Преимущество прямого метода

Главное преимущество прямого метода - это высокая, доходящая до 100%, точность диагностики и отсутствие необходимости анализа всей семьи на предмет ее информативности (см. ниже). Последнее обстоя­тельство особенно важно для проведения пренатальной диагностики тяжелых, зачастую летальных наследственных болезней (муковисци-доза, миодистрофии Дюшенна, гемофилии А и др.). Такие семьи нередко обращаются за медико-генетической помощью уже после того, как больной ребенок умер. Так, по нашим наблюдениям, до 80% семей с высоким риском муковисцидоза обращаются по поводу необходимости дородовой диагностики уже после смерти больного ребенка [Baranov V.S. et al., 1992].
Однако существует огромное количество наследственных болезней, для которых мутации не описаны либо не найдено мажорных мутаций в исследуемых популяциях. Даже во всех тех случаях, когда имеются ма­жорные мутации, наряду с ними описаны многочисленные редко встре­чающиеся (вплоть до единичных случаев) так называемые минорные мутации. Кроме того, всегда сохраняется возможность присутствия у пробанда неизвестных мутаций, а клонирование гена больного человека для целей прямого секвенирования, даже ограниченного только смысло­вой его частью - кДНК, далеко не всегда возможно в силу очевидных финансовых и временных ограничений такого подхода. Эти трудности успешно преодолеваются благодаря наличию непрямых (косвенных) методов молекулярной диагностики.
Этот исторически более ранний подход основан на использовании сцепленных с геном полиморфных маркеров, с помощью которых про­водится идентификация мутантных хромосом (точнее хромосом, несущих мутантный ген) в семьях высокого риска, т. е. у родителей больного и его ближайших родственников. В настоящее время косвенные методы  молекулярной диагностики принципиально возможны практически для всех моногенных заболеваний с известной локализацией контролирую­щего гена, для каждого из которых уже разработана удобная система вне- и внутригенных полиморфных индексных маркеров.

ПРЯМЫЕ И КОСВЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

 
Локализация и клонирование последовательностей кДНК генов от­крывают принципиально новые возможности диагностики наследствен­ных заболеваний, основанные на исследовании мутантных аллелей у пациентов, членов их семей или у предполагаемых гетерозиготных но­сителей патологических мутаций. Это в равной мере относится и к пре-натальной диагностике, которая может быть проведена с использованием молекулярных методов анализа на самых ранних стадиях развития плода. Эти же подходы вполне приемлемы для диагностики до появления каких-либо клинических или биохимических симптомов бо­лезни (досимптоматическая диагностика), что позволяет выработать и начать рациональную тактику лечения (упреждающая терапия), а также эффективно выявлять гетерозиготных носителей в семьях высокого риска, что является важным фактором профилактики наследственных болезней. Решающими преимуществами молекулярной диагностики являются ее универсальность, возможность использовать для анализа любые ДНК-содержащие клетки или ткани, причем анализ может быть произведен на любых стадиях онтогенеза, начиная со стадии зиготы.
Принципиально различают прямую и непрямую ДНК-диагностику моногенных наследственных болезней. В общем случае использование прямых методов диагностики возможно лишь для клонированных генов с известной нуклеотидной последовательностью полноразмерной кДНК, при этом необходимо предварительное генотипирование мутантных аллелей у родителей. В случае прямой диагностики объектом молеку­лярного анализа является сам ген, точнее мутации этого гена, идентифи­кация которых и составляет основную задачу исследования. Такой подход особенно эффективен при наличии точной информации о природе, частоте и локализации наиболее распространенных (доминирующих по частоте) мутаций соответствующих генов, а также о наличии в них осо­бенно легко мутирующих «горячих» точек. К таковым относятся мутация delF508 и ряд других мутаций при муковисцидозе, делеционные мутации при миодистрофии Дюшенна, мутация R408W при фенилкето-нурии, инверсионная мутация при гемофилии А, протяженная делеция при адреногенитальном синдроме, экспансии триплетных повторов в случае «динамических» мутаций при синдроме ломкой Х-хромосомы и при ряде других нейродегенеративных заболеваний. Методы, используемые для направленного поиска этих мутаций, под­робно рассмотрены в главе 4. В ряде случаев (муковисцидоз, фенилке-тонурия, серповидно-клеточная анемия) эти методы удалось автомати­зировать, что позволяет одновременно тестировать сразу несколько (до 30 и более) различных мутаций. При этом появляется реальная возможность выявлять свыше 95 - 98% мутантных хромосом, что делает целе­сообразным и экономически оправданным скринирование всей популя­ции отдельных стран на выявление мутантных особей для последующей организации эффективных профилактических мероприятий, направлен­ных на предупреждение рождения больных детей. Подобные программы по муковисцидозу уже успешно проводятся в ряде стран Западной Ев­ропы (в Великобритании, Дании, Франции) и Северной Америки.

Использование экспрессионных библиотек

Использование экспрессионных библиотек для изоляции кодирующих последовательностей гена рассматривалось ранее. После секвенирования кДНК можно, исходя из генетического кода, про­гнозировать аминокислотный состав белка и произвести компьютерный поиск в банке данных гомологичных последовательностей в составе белков с уже известной структурой и функциями. Выявление родствен­ных белков, близких по своему полипептидному составу, значительно ускоряет и облегчает дальнейший молекулярный анализ функциониро­вания исследуемого белка в клетке. Аминокислотная последовательность белка позволяет прогнозировать его третичную структуру, иден­тифицировать домены, оценивать функциональную значимость целого белка и отдельных его компонентов. Не менее важным практическим следствием этих данных является также возможность получения антител к строго специфичным участкам белка. Для этого могут быть использо­ваны два подхода - биохимический и молекулярно-генетический. В пер­вом случае для иммунизации используют искусственно синтезированные полипептиды, которые пришивают к белковой молекуле-носителю (гаптену). Размеры таких полипептидов обычно не превышают 30 ами­нокислот - они не могут быть очень большими из-за высокой стоимости и трудоемкости синтеза длинных молекул. При втором подходе экзон-ные участки гена инсертируют в экспрессионный вектор в область, кодирующую селектируемый белок. В результате экспрессии такой конструкции получают слитый белок, в котором наряду с аминокис­лотной последовательностью селектируемого маркера содержится оп­ределенный фрагмент исследуемого белка. Эту химерную молекулу и используют для иммунизации животных и получения моновалентных или моноклональных антител. При наличии антител могут быть применены различные иммунологические подходы для анализа тканеспе-цифического и внутриклеточного распределения белка, исследования его модификаций, а также для получения нативного белка в препаративных количествах.

Три типа экспрессионных систем

Существует три типа экспрессионных систем - бактериальные, скон­струированные обычно на основе Е. coli, дрожжевые и экспрессионные культуры клеток млекопитающих. Каждая из этих систем имеет свои преимущества и недостатки. Бактериальные системы наиболее удобны для клонирования, обладают высоким уровнем экспрессии (до 1-2 г белка на литр культуры) и их используют обычно для производства большого количества чистого белка, необходимого для получения антител или для фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введения изменений в различные районы полипептидной цепи путем сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последовательности чуже­родной ДНК. Получение и исследование таких «мутантных» белков очень важно для оценки функциональной значимости различных участков белка.
Уровень экспрессии чужеродных белков в дрожжевых клетках вдвое, а в клетках млекопитающих - в десятки раз ниже, чем в бактериальных. Однако в бактериальных клетках отсутствуют ферментативные системы, обеспечивающие процессинг эукариотических белков. Поэтому эука-риотические системы удобнее использовать для изучения посттрансля­ционных модификаций белка - гликозилирования, т. е. присоединения к полипептидной цепи углеводных остатков; скручивания белка с образо­ванием третичной структуры, часто за счет возникновения дисульфид-ных связей; и N-концевых модификаций, стабилизирующих структуру белка. В ДНК-экспрессионных системах может быть синтезировано дос­таточно много белка, чтобы получить его в кристаллической форме и исследовать пространственную структуру и функциональное назначение отдельных доменов [Хэймс Б., Хиггинс С, 1987].

НАЛИЗ ТРАНСЛЯЦИИ. ДНК-ЭКСПРЕССИОННЫЕ СИСТЕМЫ

Традиционные методы анализа регуляции трансляции и посттранс­ляционных модификаций белков основаны на использовании модельных систем, представляющих собой цитоплазматические, свободные от мРНК, безъядерные экстракты клеток, содержащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор аминокислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга белков [Хэймс Б., Хиггинс С, 1987; Клеменс М., 1987]. После добавления к такой системе специфической мРНК происходит синтез соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки после электрофоретической очистки могут быть идентифицированы путем радиоавтографии либо иммунологическими методами при наличии соответствующих антител [Клеменс М., 1987]. Однако для зна­чительного числа моногенных наследственных заболеваний первичный биохимический дефект неизвестен, а следовательно, не идентифициро­ваны и мРНК-транскрипты. Биохимическое изучение многих белков затруднено из-за их минорного содержания и отсутствия эффективных методов выделения и очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере относится к нерастворимым белкам, ассоциированным с мем­бранными структурами клеток.
ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культуры, синте­зирующие чужеродные белки, являются очень мощным средством ана­лиза структуры, функции и синтеза белков [Sambrook J. et al., 1989]. Такие системы конструируют на основе экспрессионных векторов, содержащих в своем составе сильные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечивающие высокий, но в то же время регулируемый уровень экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-инже­нерных приемов в область действия этих промоторов. Конечно, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы, в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным генам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию чужеродных белков в клетках.

Матричная РНК

Матричная РНК является наиболее удобным объектом для изучения регуляции транскрипции генов и посттранскрипционных модификаций РНК. Тотальная клеточная РНК состоит на 90 - 95% из рибосомальных и транспортных РНК, тогда как доля транслируемых или poly(A)+ РНК  не превышает 5% [Льюин Б., 1987]. При этом концентрация РНК-транскриптов индивидуальных генов среди всех молекул мРНК в среднем колеблется в пределах от 0,01 до 0,001% [Гайцхоки B.C., 1978]. Поэтому для обнаружения индивидуальных типов мРНК должны использоваться высокочувствительные методы. Обычным методом идентификации мРНК на тканевом и клеточном уровнях является гибридизация in situ РНК- или ДНК-зондов с молекулами мРНК на гистологических срезах [Хаффнер Р., Уиллисон К., 1990]. В качестве ДНК-зондов используют клонированные последовательности кДНК и синтетические олигонуклео-тиды. После инкубации меченых зондов на цитологических препаратах с последующей тщательной отмывкой несвязавшихся молекул положение комплементарных РНК-последовательностей в клетках определяют ра­диоавтографическими либо в случае биотинового мечения - иммуноги-стохимическими методами. Оптимальные условия гибридизации дают возможность не только выявлять присутствие специфических мРНК, но и определять их внутриклеточную локализацию [Манк М., 1990; Хаффнер Р., Уиллисон К., 1990; Non-radioactive in situ..., 1992].
Анализ индивидуальных РНК включает изоляцию из тканей пула не­поврежденных биологически активных мРНК и идентификацию среди них специфических молекул путем использования различных вариантов ДНК-РНК-гибридизации. Для генов с высоким уровнем транскрипции могут быть пригодны дот- или слот-блоты (см. главу 1). Когда источником РНК служат клетки, которые не могут быть получены в большом количестве, используют цитоплазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют и фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых проводят гибридизацию. Значительно большей чувствительностью обладает так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гибридизация с ДНК-зондами на фильтрах, предварительно сконцентрированных и фракционированных путем электрофореза молекул РНК [Sambrook J. et al., 1989]. Электрофорез проводят в агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель находится в логарифмической зависимости от длины последовательности, что позволяет точно определить размер РНК-транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосомаль-ной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы в плохо различимой, слабо окрашенной области геля, в которой отдельные типы мРНК могут быть выявлены только путем гибридизации с соответст­вующими ДНК-зондами. Нозерн-блот имеет то преимущество, что при электрофорезе могут быть разделены молекулы РНК, дающие перекре­стную гибридизацию с ДНК-зондом. Кроме того, характер электрофоре-   
    137   
    тического разделения позволяет визуально оценить качество изолиро­ванной РНК. При очень низких концентрациях специфических мРНК или в тех случаях, когда ДНК-зонды дают перекрестную гибридизацию с другими компонентами (не мРНК), проводят обогащение изолированной тотальной РНК транслируемыми мРНК путем отбора на колонках фракций, содержащих поли-А-«хвосты». Для этого выделенную РНК пропускают через короткую колонку с пришитыми поли-Т-олигонуклеотидными последовательностями и высокой концентрацией солей в буферном растворе, так чтобы молекулы мРНК, содержащие поли-А-«хвосты», задерживались на колонке. При снижении концентра­ции солей в буфере происходит расплавление А-Т-дуплексов и высво­бождение молекул мРНК. Таким способом доля этих молекул в опреде­ленных солевых фракциях может быть увеличена на два порядка. Ко­нечно, поли-А-селекция применима в тех случаях, когда имеется доста­точно большое количество тотальной РНК. Другим методом для иссле­дования структуры РНК-транскриптов является S1-анализ. В этом случае ДНК-РНК-гибридизацию ведут в растворе, куда и добавляют S1-нуклеазу для переваривания однонитевых несвязавшихся молекул как ДНК, так и РНК, после чего проводят электрофоретическую очистку дуплексов, которые затем элюируют из геля для последующего анализа [Sambrook J. et al, 1989]. Этот метод очень удобен для анализа стартовых сайтов и З'-концов генов, для определения направления транскрипции и картирования нитронов.

АНАЛИЗ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНА

ИЗОЛЯЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ МРНК. ИСКУССТВЕННЫЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ
Регуляция экспрессии генов в цепочке ДНК - РНК - белок может осуществляться на различных молекулярных уровнях. В соответствии с этим исследования дифференциальной активности генов в разных типах  клеток и тканей включают оценку работы контролирующих элементов генов, анализ молекул РНК на всех этапах от появления первичного транскрипта до зрелой мРНК и изучение соответствующего белкового продукта, включая его процессинг (созревание), внутриклеточную лока­лизацию, тканеспецифическое распределение.
Исследования регуляторных цис-действующих элементов генома, та­ких как промоторы, энхансеры, участки ДНК, подавляющие транскрип­цию, являются составной частью анализа молекулярной структуры лю­бого гена. Идентификацию таких элементов проводят с использованием разнообразных современных методов молекулярной генетики. В частно­сти, последовательности ДНК в 5'-фланкирующей области гена, ответст­венные за тканеспецифическую индукцию генной активности, могут быть локализованы путем исследования транскрипции в различных линиях клеток при введении в них генов с искусственными делециями этих участков ДНК. Для оценки активности идентифицированных регулятор­ных последовательностей их сливают с чужеродными хорошо изучен­ными неиндуцибельными клонированными генами, так называемыми «репортерами». Такие генетические конструкции в составе векторных последовательностей вводят в культивируемые клетки эукариот и на­блюдают за изменением уровня экспрессии. В качестве «репортера» часто используют ген хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ-ген), который в естественных условиях экспрессируется только в клетках прокариот. Сам фермент (CAT) обладает высокой активностью, что по­зволяет не только легко обнаруживать ее минимальные количества в клетке, но и с высокой точностью проводить количественную оценку. Для повышения чувствительности анализ экспрессии химерных генов часто проводят в культуре фибробластов почек африканской зеленой мартышки (COS-клетки). Эти клетки модифицированы таким образом, что в них после трансфекции происходит амплификация копий сконст­руированных определенным образом эписом - внехромосомных генети­ческих конструкций (см. главу 10), что ведет к значительному усилению сигналов экспрессии введенных генов (трансгенов). Перенос генов (трансгеноз) может быть осуществлен и на уровне целого организма, в частности, зиготы. Полученные в результате подобных манипуляций трансгенные животные могут быть также использованы в качестве мо­дельной системы для анализа механизмов тканеспецифической активации генов in vivo.