ГРУППЫ РИСКА. ПОИСК ГЕТЕРОЗИГОТНЫХ НОСИТЕЛЕЙ МУТАЦИЙ

Как следует из изложенного выше, точная диагностика в сочетании с детальным анализом типа наследования того или иного заболевания имеет определяющее значение для формирования групп риска, то есть отбора семей, в которых вероятность рождения больных детей повышена. Прежде всего это те семьи, где уже есть или был ребенок, страдающий каким-либо моногенным наследственным заболеванием. Для ауто-сомно-рецессивных болезней с большой долей вероятности можно считать, что оба родителя этого ребенка являются гетерозиготными носителями мутантных аллелей соответствующего гена, и риск повторного рождения больного ребенка в такой семье составляет 25%, независимо от исхода предыдущих родов. Поэтому в таких случаях рекомендуется обязательная пренатальная диагностика плода при каждой последующей беременности.
Для сцепленных с полом заболеваний важной практической задачей является выявление случаев спонтанного возникновения мутаций в ро­дительском поколении. Для таких распространенных заболеваний, как миодистрофия Дюшенна и гемофилия А, почти треть всех случаев имеет спонтанное происхождение. При этом мутации гена дистрофина, как правило, возникают в оогенезе, то есть у матери, а мутации гена фактора VIII, обычно, появляются во время сперматогенеза у деда больного ре­бенка. В отличие от тех семей, в которых мать гетерозиготна, вероятность повторного рождения больного ребенка в семьях со спонтанной мутацией не превышает среднепопуляционной частоты, и потому нет необходимости проводить пренатальную диагностику плода при последующих беременностях. Специального рассмотрения в этой связи заслуживает, однако, вопрос гонадного мозаицизма, т. е. наличия в гонадах матери генетически нормальных и мутантных ооцитов. Особенно велик риск такого состояния в случае миодистрофии Дюшенна. Го­надный мозацизм в силу своей органной специфики достаточно трудно доказать или опровергнуть. Между тем, считается что 6,7 % спорадиче­ских случаев миодистрофии Дюшенна обусловлены гонадным мозаи-цизмом у матери [Essen A.J. et al., 1992].

Разработка молекулярных методов диагностики болезней

Разработка молекулярных методов диагностики болезней, вызванных мутациями в митохондриальных генах, как показывают исследования последних лет [McKusick V.A., 1994], приобретает особое значение. Как правило, в основе различных «митохондриальных» болезней лежат на­рушения в системе окислительного фосфорилирования. Поскольку не­которые ткани обладают повышенной чувствительностью к подобным  нарушениям, сходная клиническая картина заболеваний может наблю­даться вследствие мутаций разных митохондриальных генов. Наследо­вание таких болезней значительно отличается от менделевского типа, в первую очередь, из-за материнского характера наследования митохонд­рий, наличия в зиготе и, соответственно, во всех клетках организма большого числа копий митохондриальных хромосом, из-за особенностей сегрегации этих хромосом при делении клеток и, наконец, из-за тех количественных и качественных изменений в митохондриальной ДНК, которые сопровождают процессы онтогенетической дифференцировки клеток и старения организма.
Для всех «митохондриальных» болезней характерен материнский тип наследования и присутствие мутантных аллелей только в части хромосом (так называемая гетероплазмия), доля которых может варьировать в разных тканях. Как правило, существует определенное пороговое значе­ние доли мутантных хромосом, превышение которого ведет к появлению и прогрессированию заболевания. Сокращение числа митохондрий, происходящее в норме при старении, может способствовать увеличению доли мутантных хромосом в определенных тканях и тем самым быть причиной болезни. Не случайно поэтому для многих «митохондриальных болезней» характерно позднее начало. В силу функциональных осо­бенностей митохондриальных генов часто наблюдается кумулятивный эффект двух и более мутаций, локализованных в разных генах. Важным представляется также то обстоятельство, что в митохондриальных генах OXPHOS-комплекса частота возникновения мутаций выше, чем в ядер­ных генах, кодирующих субъединицы окислительного фосфорилирова-ния [McKusick V.A., 1994].

При доминантном наследовании

При доминантном наследовании для развития болезни достаточно одного мутантного аллеля. Такие больные с вероятностью 50% рождаются в семьях, где один из родителей болен. Очень редко больные дети с доминантным типом наследования могут родиться и у здоровых роди­телей в результате мутирования одной из гамет. Однако вероятность повторного рождения больного ребенка в такой семье такая же, как и для популяции в целом. Пренатальная диагностика доминантных болезней проводится достаточно редко по ряду причин. Во-первых, такие болезни составляют относительно небольшой процент среди всех моногенных заболеваний. Во-вторых, тяжелые болезни, сопровождающиеся летальным исходом в раннем возрасте или приводящие к бесплодию, не передаются по наследству, а появляются каждый раз заново вследствие мутации при созревании гамет. Необходимость же предотвращения рождения больных, которые не только доживают до репродуктивного возраста, но и способны оставить потомство, является вопросом дискуссионным. Проведение пренатальной диагностики таких заболеваний принимается с учетом многих конкретных обстоятельств. Актуальность этой проблемы стала особенно очевидной в последние годы, когда была открыта многочисленная группа доминантных нейродегенеративных заболеваний которые проявляются сравнительно поздно, нередко уже в репродуктивном возрасте, тяжело протекают и по сути не имеют сколько-нибудь реальной терапии. Для таких заболеваний первостепенное значение приобретают методы досимптоматической диагностики с использованием анализа ДНК.
Значительно больше распространены моногенные болезни с частич­ным доминированием и неполной пенетрантностью. Для подобных забо­леваний риск рождения больного ребенка в отягощенной семье зависит от конкретных значений этих параметров, которые, в свою очередь, определяются молекулярными механизмами, лежащими в основе формирования такого рода отклонений от менделевского типа наследования.

Y-хромосома

Y-хромосома содержит очень мало генов, большинство из которых (около 10) картировано в так называемой псевдоаутосомной области короткого плеча, гомологичной таковой на коротком плече X-хромосомы. Важнейшим истинным геном Y-хромосомы, т. е. геном, представленным только на этой хромосоме, является ген SRY (Yp21.1), детерминирующий развитие пола по мужскому типу. Мутации этого регуляторного гена приводят к нарушениям половой дифференцировки (XY-женщины), а его перенос вследствие ошибок рекомбинации псев-доаутосомных районов на короткое плечо Х-хромосомы обусловливает синдром реверсии пола - Sex reverse (ХХ-мужчины) [McElreavey К. et al., 1993]. Практически важно, что присутствие даже небольшого околоцен-тромерного фрагмента длинного плеча Y-хромосомы при кариотипе XX является безусловным показанием для удаления зачатков гонад у таких индивидуумов в связи с высокой вероятностью экспрессии гена Gba, ведущего к их злокачественному перерождению - гонадобластоме [Giquel С. et al., 1992]. В отличие от Y-хромосомы, большая по размеру Х-хромосома человека несет до 5% всех структурных генов, многие из которых уже идентифицированы.
Все рецессивные аллели Х-хромосомы у мальчиков проявляются, так как находятся в гемизиготном состоянии. Девочки могут болеть в том случае, если они гомозиготны по мутации. Такая возможность может осуществиться в семье, где болен их отец, а мать является носительницей мутации и передала дочери свой мутантный аллель. Если отец больной девочки здоров, можно предполагать, что мутация возникла в той его гамете, которая участвовала в оплодотворении. Х-сцепленные заболевания у девочек (миодистрофия Дюшенна, гемофилия А) могут быть следствием сочетанного проявления мутации этих генов у одного из родителей и делеции соответствующих фрагментов хромосом у другого. В этих редких случаях у девочек, как и у мальчиков, мутации X-сцепленных генов будут находиться в гемизиготном состоянии.

ДНК-ДИАГНОСТИКА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ НАСЛЕДОВАНИЯ

Напомним, что значительное число моногенных заболеваний насле­дуется по рецессивному типу. Это значит, что при аутосомной локали­зации соответствующего гена болеют только гомозиготные носители мутаций. Гетерозиготы клинически здоровы, но с равной вероятностью передают своим детям мутантный или нормальный варианты гена. Таким образом, на протяжении длительного времени мутация в скрытом виде может передаваться из поколения в поколение. При аутосомно-рецессивном типе наследования в родословных тяжелых больных, кото­рые либо не доживают до репродуктивного возраста, либо имеют резко сниженные потенции к размножению, редко удается выявить больных родственников, особенно по восходящей линии. Исключение составляют семьи с повышенным уровнем инбридинга, который возникает либо за счет высокой частоты близкородственных браков, либо за счет вступ­ления в брак людей из одинаковых изолированных популяций ограни­ченной численности. Больные дети с вероятностью 25% рождаются в тех семьях, где оба родителя являются гетерозиготными носителями мутаций одного и того же гена. Возможно также рождение больного ребенка в такой семье, где только один из супругов несет мутацию, а вторая мутация возникла в гамете его партнера в момент, предшествующий оплодотворению. Доля таких семей в общей группе риска относительно невелика, а риск повторного рождения в них больного ребенка не превышает общей частоты спонтанного возникновения мутаций в данном гене. Для болезней, сцепленных с полом, то есть контролируемых генами, локализованными в Х-хромосоме, характерно то, что болеют пре­имущественно мальчики, тогда как носителями являются девочки.

Изучение полиморфных маркеров

Все эти недостатки могут быть устранены при использовании в каче­стве молекулярных маркеров высокополиморфных тандемно повто­ряющихся коротких три- и тетрамерных повторов (STR). Для многих генов найдены уникальные паттерны полиморфных аллелей, отличающихся по числу «коровых» единиц повторяющихся последова­тельностей нуклеотидов. Такие «количественные» полиморфизмы , как уже упоминалось, очень широко распространены по всему геному и присутствуют в интронных и фланкирующих областях многих генов. Появление в конце 1994 г. 0,7 сМ-ой карты генома человека, по­строенной на базе высокололиморфных динуклеотидных (С-А)п-повто-ров, сделало реальным маркирование практически любого картирован­ного гена. Особенную диагностическую ценность представляют внутригенные маркеры, для которых резко снижена вероятность кроссинговера с мутантными аллелями гена, а следовательно, особенно высока точность диагностики. Кроме того, как оказалось, многие внутригенные полиморфные короткие тандемные повторы обнаруживают сильное не­равновесие по сцеплению с определенными мутантными аллелями гена, что значительно облегчает их идентификацию в отягощенных семьях. Индекс гетерозиготности таких полиаллельных мини- и микросателлит-ных систем нередко превышает 0,8. Их применение позволяет маркиро­вать, т. е. сделать информативными для ДНК-диагностики, практически все семьи высокого риска при условии наличия больного ребенка или доступности для молекулярного анализа его патанатомиче-ского материала.
Изучение полиморфных маркеров у больного и его родителей и вы­яснение аллельной природы молекулярного маркера, так называемое «определение фазы сцепления» , составляет основу для даль­нейшей диагностики косвенными методами [Евграфов О.В., Макаров В.Б., 1987]. Применение косвенных методов молекулярной диагностики предусматривает также в качестве обязательного предварительного этапа исследование частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анализируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носителей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и не­равновесности по сцеплению между маркерными сайтами и мутантными аллелями гена. Такие исследования проводятся с помощью методов блот-гибридизации по Саузерну либо ПЦР. В первом случае в распоряжении исследователя должны быть соответствующие ДНК-зонды, во втором - должны быть известны нуклеотидные последовательности районов ДНК, включающие соответствующие полиморфные сайты, для выбора олигопраймеров

Косвенные методы молекулярной диагностики

Более того, косвенные методы молекулярной диагностики пригодны даже для тех болезней, гены которых еще не идентифицированы и мута­ции неизвестны. Единственным и непременным условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрикции либо коротких тандемных повторов, типа STR, находящихся в непосредственной близости от му-тантного гена или, что еще лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих полиморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена и проследить их передачу потомству (см. главу 3). Ранние иследования непрямым методом проводились почти исключительно с использованием полиморфных сайтов рестрикции - двухаллельной сис­темы, информативная емкость которой не превышает 50%, а реальная частота гетерозигот по данному признаку в популяции оказывается су­щественно ниже 0,5. Следовательно, в лучшем случае только половина гетерозиготных носителей наследственного заболевания, вызванного рецессивной мутацией какого-нибудь гена, могла быть доступна непря­мой молекулярной диагностике с использованием одного полиморфного сайта рестрикции. Повышение информативности в случае ПДРФ-анализа могло быть достигнуто только путем увеличения числа полиморфных сайтов. Как правило, для диагностики необходим не один, а 3 -4 полиморфных сайта, что далеко не во всех случаях возможно. Многие из полиморфных сайтов локализованы вне генов на расстояниях, при которых кроссинговер может в заметном проценте случаев исказить результаты диагностики. Кроме того, практическое использование рест-рикционных сайтов зачастую затруднено из-за отсутствия или большой стоимости соответствующих эндонуклеазных рестриктаз.