Матричная РНК

Матричная РНК является наиболее удобным объектом для изучения регуляции транскрипции генов и посттранскрипционных модификаций РНК. Тотальная клеточная РНК состоит на 90 - 95% из рибосомальных и транспортных РНК, тогда как доля транслируемых или poly(A)+ РНК  не превышает 5% [Льюин Б., 1987]. При этом концентрация РНК-транскриптов индивидуальных генов среди всех молекул мРНК в среднем колеблется в пределах от 0,01 до 0,001% [Гайцхоки B.C., 1978]. Поэтому для обнаружения индивидуальных типов мРНК должны использоваться высокочувствительные методы. Обычным методом идентификации мРНК на тканевом и клеточном уровнях является гибридизация in situ РНК- или ДНК-зондов с молекулами мРНК на гистологических срезах [Хаффнер Р., Уиллисон К., 1990]. В качестве ДНК-зондов используют клонированные последовательности кДНК и синтетические олигонуклео-тиды. После инкубации меченых зондов на цитологических препаратах с последующей тщательной отмывкой несвязавшихся молекул положение комплементарных РНК-последовательностей в клетках определяют ра­диоавтографическими либо в случае биотинового мечения - иммуноги-стохимическими методами. Оптимальные условия гибридизации дают возможность не только выявлять присутствие специфических мРНК, но и определять их внутриклеточную локализацию [Манк М., 1990; Хаффнер Р., Уиллисон К., 1990; Non-radioactive in situ..., 1992].
Анализ индивидуальных РНК включает изоляцию из тканей пула не­поврежденных биологически активных мРНК и идентификацию среди них специфических молекул путем использования различных вариантов ДНК-РНК-гибридизации. Для генов с высоким уровнем транскрипции могут быть пригодны дот- или слот-блоты (см. главу 1). Когда источником РНК служат клетки, которые не могут быть получены в большом количестве, используют цитоплазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют и фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых проводят гибридизацию. Значительно большей чувствительностью обладает так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гибридизация с ДНК-зондами на фильтрах, предварительно сконцентрированных и фракционированных путем электрофореза молекул РНК [Sambrook J. et al., 1989]. Электрофорез проводят в агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель находится в логарифмической зависимости от длины последовательности, что позволяет точно определить размер РНК-транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосомаль-ной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы в плохо различимой, слабо окрашенной области геля, в которой отдельные типы мРНК могут быть выявлены только путем гибридизации с соответст­вующими ДНК-зондами. Нозерн-блот имеет то преимущество, что при электрофорезе могут быть разделены молекулы РНК, дающие перекре­стную гибридизацию с ДНК-зондом. Кроме того, характер электрофоре-   
    137   
    тического разделения позволяет визуально оценить качество изолиро­ванной РНК. При очень низких концентрациях специфических мРНК или в тех случаях, когда ДНК-зонды дают перекрестную гибридизацию с другими компонентами (не мРНК), проводят обогащение изолированной тотальной РНК транслируемыми мРНК путем отбора на колонках фракций, содержащих поли-А-«хвосты». Для этого выделенную РНК пропускают через короткую колонку с пришитыми поли-Т-олигонуклеотидными последовательностями и высокой концентрацией солей в буферном растворе, так чтобы молекулы мРНК, содержащие поли-А-«хвосты», задерживались на колонке. При снижении концентра­ции солей в буфере происходит расплавление А-Т-дуплексов и высво­бождение молекул мРНК. Таким способом доля этих молекул в опреде­ленных солевых фракциях может быть увеличена на два порядка. Ко­нечно, поли-А-селекция применима в тех случаях, когда имеется доста­точно большое количество тотальной РНК. Другим методом для иссле­дования структуры РНК-транскриптов является S1-анализ. В этом случае ДНК-РНК-гибридизацию ведут в растворе, куда и добавляют S1-нуклеазу для переваривания однонитевых несвязавшихся молекул как ДНК, так и РНК, после чего проводят электрофоретическую очистку дуплексов, которые затем элюируют из геля для последующего анализа [Sambrook J. et al, 1989]. Этот метод очень удобен для анализа стартовых сайтов и З'-концов генов, для определения направления транскрипции и картирования нитронов.