Анализ делеции в аутосомных генах

Метод этот, однако, не обнаруживает подобные делеции, находящиеся в гетерозиготном состоянии или локализованные в аутосомных генах, так как нормальная гомологичная последовательность геномной ДНК может служить матрицей для амплификации любых фрагментов. Данный подход применим к анализу делеции в аутосомных генах только в тех случаях, когда возможно дополнить ПЦР количественной оценкой результатов амплификации, провести так называемую количественную ПЦР. Оригинальный метод идентификации подобных делеции у гетерозигот основан на использовании в качестве матричной ДНК для ПЦР кДНК, полученной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей или культур клеток пациента. В отличие от нормального гомолога, в мутантной молекуле кДНК граничащие с делецией экзоны сближены. Если в качестве олигопраймеров для ПЦР будут выбраны последо­вательности из этих областей гена, только мутантная кДНК будет служить матрицей для амплификации небольшого участка между прайме-рами из фланкирующих делецию экзонов. В нормальной последовательности кДНК этот участок может быть слишком велик для того, чтобы прошла амплификация. Практически для обнаружения гетерозигот по протяженным внутригенным делециям проводят мультиплексную ПЦР с использованием системы олигопраймеров, обеспечивающих амплифи­кацию фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Наличие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации необычного размера.
Небольшие делеции и вставки нуклеотидов не приводят к отсутствию амплифицированных фрагментов ДНК, но изменяют их размеры. Эти изменения могут быть зарегистрированы при электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном или агарозном гелях . Именно этот метод используется для детекции наиболее часто встречающейся мутации в гене муковисцидоза - делеции трех нуклеотидов - AF508. После выявления различий между нормальной и мутантной ДНК по длине рестрикционных или амплифи-цированых фрагментов гена необходимо провести секвенирование необычного фрагмента с целью определения изменений в первичной структуре мутантной ДНК-последовательности по сравнению с нормальной.