Интегри­рованный молекулярный анализ экспрессирующихся последовательно­стей ДНК

Огромное значение для картирования генов человека имеет интегри­рованный молекулярный анализ экспрессирующихся последовательно­стей ДНК. Программы подобного анализа включают изоляцию и секве-нирование коротких последовательностей ДНК из существующих биб­лиотек кДНК генов, так называемых EST (expressed sequence tag). Локализация этих последовательностей на генетических картах переводит их в форму STS и маркирует присутствие генов в определенных сегментах ДНК. В настоящее время секвенировано около 200 000 EST. Конечно, количество разных генов, фрагментами которых являются эти последо­вательности, значительно меньше. Тем не менее предполагается, что с помощью этой техники удастся картировать подавляющее большинство генов человека уже в ближайшие 2-3 года. Важнейшим элементом этой работы является разработка методов совмещения генетических карт с картами микросателлитных индексных маркеров и EST-последо-вательностей.
Как уже отмечено ранее, кодирующие области генов, представленные в геноме уникальными последовательностями, достаточно консервативны в процессе эволюции. Существует высокий процент гомологии в структуре ДНК между одинаковыми генами у разных видов млекопи­тающих. На этом факте основан так называемый зооблот - скрининг клонированных последовательностей, не содержащих повторов, но дающих перекрестную гибридизацию с геномной ДНК, выделенной из разных видов животных: приматов, сельскохозяйственных животных, грызунов, птиц, рептилий. Клоны, содержащие консервативные после­довательности, подвергают дальнейшему анализу на присутствие в ин-сертированных фрагментах ДНК CpG-островков, часто маркирующих 5'-фланкирующие области генов позвоночных, особенно генов «домашнего хозяйства» ( см. главу 2, 2.4), и исследуют наличие открытых рамок считывания - ORF (open reading frames). Дальнейший поиск генов в более узком интервале может быть осуществлен с помощью компьютерного анализа соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК. Кроме того, все клонированные ДНК из этого интервала могут быть сразу использованы для анализа РНК-транскриптов [Iannuzzi М.С., Collins F.S., 1990].