НАЛИЗ ТРАНСЛЯЦИИ. ДНК-ЭКСПРЕССИОННЫЕ СИСТЕМЫ

Традиционные методы анализа регуляции трансляции и посттранс­ляционных модификаций белков основаны на использовании модельных систем, представляющих собой цитоплазматические, свободные от мРНК, безъядерные экстракты клеток, содержащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор аминокислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга белков [Хэймс Б., Хиггинс С, 1987; Клеменс М., 1987]. После добавления к такой системе специфической мРНК происходит синтез соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки после электрофоретической очистки могут быть идентифицированы путем радиоавтографии либо иммунологическими методами при наличии соответствующих антител [Клеменс М., 1987]. Однако для зна­чительного числа моногенных наследственных заболеваний первичный биохимический дефект неизвестен, а следовательно, не идентифициро­ваны и мРНК-транскрипты. Биохимическое изучение многих белков затруднено из-за их минорного содержания и отсутствия эффективных методов выделения и очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере относится к нерастворимым белкам, ассоциированным с мем­бранными структурами клеток.
ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культуры, синте­зирующие чужеродные белки, являются очень мощным средством ана­лиза структуры, функции и синтеза белков [Sambrook J. et al., 1989]. Такие системы конструируют на основе экспрессионных векторов, содержащих в своем составе сильные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечивающие высокий, но в то же время регулируемый уровень экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-инже­нерных приемов в область действия этих промоторов. Конечно, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы, в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным генам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию чужеродных белков в клетках.