МОЛЕКУЛЯРНОЕ СКАНИРОВАНИЕ ИЗВЕСТНЫХ МУТАЦИЙ

Рассмотренные выше методы обнаружения мутаций предполагают обязательное секвенирование содержащих их сегментов ДНК с целью точной идентификации нуклеотидных нарушений, оценки их фенотипи-ческого проявления и определения причастности к развитию болезни. Поэтому они редко используются в практической диагностике н при популяционном скрининге гетерозигот. После описания мутации появляется возможность ее анализа более простыми способами, не требующими секвеннрования. Как упоминалось выше, мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов, могут быть выявлены с помощью нативного электрофореза в полиакриламидном или агарозном 'гелях.
Из миссенс-мутаций наиболее просто диагностируются те замены нуклеотидов, которые приводят к исчезновению или образованию сайта узнавания для какой-нибудь из рестрнктаз. Они выявляются по изменению длины амплифицированного фрагмента ДНК после его обработки соответствующей эндонуклеазой. Поэтому сразу после идентификации мутации проводится компьютерный поиск возможных сайтов рестрикции в месте локализации замены основания. Вероятность такого события довольно велика, так как для каждой из нескольких сотен известных в настоящее время рестрнкционных эндонуклеаз сайтом узнавания служит своя специфическая последовательность ДНК, средние размеры которой составляют 5-6 нуклеотидов.
Если естественных рестрнкционных сайтов в месте мутации найти не удается, то такие сайты могут быть созданы искусственно. В частности, разработана методика создания с помощью ПЦР новых сайтов рестрикции в мутантных аллелях, но не в аллелях дикого типа -метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза [Eiken H.G. et al., 1991; Ngo I.C.L. et al., 1991 ]. Для этого амплнфнцнруе-мый участок ДНК выбирают таким образом, чтобы З'-конец одного из праймеров непосредственно примыкал к мутантному сайту (рис. 4.8). Именно этот праймер неполностью комплементарен матричной ДНК. В нем изменяют одни нз нуклеотидов с З'-конца так, чтобы в сочетании с нуклеотндом мутантного, но не нормального сайта в этом месте образовывался сайт рестрикции для какой-нибудь из эндонуклеаз. Тогда после рестрикции и электрофореза продуктов амплификации геномной ДНК у индивидуумов, не содержащих данную мутацию, на электрофореграмме будет присутствовать один нерест-рицированный фрагмент, у гетерозигот появится два дополнитель­ных фрагмента, соответствующих по длине рестрнцированным сегментам ДНК, н у гомозигот по мутации будут присутствовать только эти два фрагмента.