Предварительная иммобилизация мутантных и нормальных ASO-зондов

Предварительную иммобилизацию мутантных и нормальных ASO-зондов на мембранах осуществляют за счет присоединения гомополимерных Т-хвостов с дезоксирибонуклеотидтрансферазой на конце. При этом олигонуклеотидные последовательности остаются свободными и могут участвовать в гибридизации с мечеными амплифицированными фрагмен­тами ДНК. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК радиоавтографи­ческие или цветные пятна на фильтрах становятся заметными только в местах локализации олигонуклеотидов, полностью комплементарных тес­тируемой геномной ДНК. Реакцию обычно проводят в присутствии ионов тетраалкиламмония, уменьшающих зависимость температуры плавления от композиции оснований. Это позволяет использовать одинаковые усло­вия гибридизации для различных олигонуклеотидов, т. е. вести поиск сразу нескольких типов мутаций, локализованных в одном и том же экзоне гена. Данный метод положен в основу разработки специальных систем, предназначенных для одновременной детекции наиболее распространен­ных мутаций в исследуемом гене. Система представляет собой ленточный фильтр (стрип) с нанесенными пятнами олигопраймеров, каждый из кото­рых соответствует определенной мутации. Стрип помещают в раствор со смесью тех меченых амплифицнрованных экзонов, которые могут содер­жать тестируемые мутантные аллели и создают условия для аллель-специфической гибридизации. Таким способом сканируют одновременно 42 мутации, ответственные за серповидно-клеточную анемию, 34 мутации -при муковисцидозе [Chebab F.F., 1993].
Очень простой метод обнаружения и идентификации описанных ранее мутаций в амплифицированных фрагментах ДНК основан на анализе ха­рактера электрофоретического разделения продуктов ПЦР в MDE-гидросвязывающих гелях в присутствии высоких концентраций мочевины. Эти гели способствуют формированию гетеродуплексов в процессе электрофореза, причем расположение дуплексов очень специфично для различных мутантных аллелей, локализованных в одном и том же ампли-фицированном фрагменте. Это позволяет не только выявлять, но с высокой степенью вероятности идентифицировать известные мутации. В мультиплексном варианте методики возможен одновременный поиск мутаций в нескольких амплифицированных фрагментах. Простота и высокая скорость анализа способствуют разработке на основе разделения в MDE-гелях схем максимальной автоматизации процесса поиска и идентификации известных мутаций у пациентов и гетерозиготных носителей мутаций.