секвенирование полноразмерной кДНК

Однако в общем случае секвенирование полноразмерной кДНК, или всех экзонов, для генотипирования мутаций у отдельных пациентов дос­таточно трудоемко, дорого и требует больших затрат времени. Поэтому на практике чаще проводят предварительный отбор более простыми методами амплифицированных, а иногда клонированных фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации, а затем секвенируют только эти участки ДНК. Методы поиска фрагментов ДНК, предполо­жительно содержащих мутации, основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных последовательностей по целому ряду физиче­ских и химических характеристик, которые в значительной степени варьируют в зависимости от типа мутационного повреждения. Следует подчеркнуть, что, независимо от метода детекции мутации и практически независимо от ее природы (замены нуклеотидов, делеции, дупликации и пр.), точные молекулярные характеристики каждой мутации могут быть получены только путем прямого секвенирования. При наличии в амплифицированном фрагменте известных сайтов рестрикции положе­ние мутации может быть предварительно уточнено. Для этого продукты амплификации разрезают соответствующей эндонуклеазой и исследуют более короткие фрагменты.
Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие длину ам­плифицированных фрагментов, так как подобные нарушения легко вы­являются при электрофоретическом анализе. Так, протяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть выявлены по изменению дли­ны рестрикционных фрагментов, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Более простая и эффективная методика выявления таких мутаций в генах, сцепленных с полом, основана на одновременной ам­плификации различных экзонов, наиболее часто вовлекаемых в подобные перестройки, так называемый мультиплексный вариант ПЦР. Разница в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет легко идентифицировать такие мутации на электрофорезе. Особенно широко этот метод используется для идентификации делеции в гене дистрофина, на долю которых приходится около 60% всех мутаций, приводящих к миодистрофии Дюшенна. При отсутствии делеции все амплифицированные фрагменты после электрофоретиче-ского разделения и окрашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Если в исследуемой ДНК какие-то из экзонов делегированы, будут отсутствовать и соответствующие им полосы на электрофореграмме. Выбирая специфические участки гена для амплификации, можно оценить размер делеции с точностью до отдельных экзонов, а также определить ее внутригенную локализацию.