Изучение полиморфных маркеров

Все эти недостатки могут быть устранены при использовании в каче­стве молекулярных маркеров высокополиморфных тандемно повто­ряющихся коротких три- и тетрамерных повторов (STR). Для многих генов найдены уникальные паттерны полиморфных аллелей, отличающихся по числу «коровых» единиц повторяющихся последова­тельностей нуклеотидов. Такие «количественные» полиморфизмы , как уже упоминалось, очень широко распространены по всему геному и присутствуют в интронных и фланкирующих областях многих генов. Появление в конце 1994 г. 0,7 сМ-ой карты генома человека, по­строенной на базе высокололиморфных динуклеотидных (С-А)п-повто-ров, сделало реальным маркирование практически любого картирован­ного гена. Особенную диагностическую ценность представляют внутригенные маркеры, для которых резко снижена вероятность кроссинговера с мутантными аллелями гена, а следовательно, особенно высока точность диагностики. Кроме того, как оказалось, многие внутригенные полиморфные короткие тандемные повторы обнаруживают сильное не­равновесие по сцеплению с определенными мутантными аллелями гена, что значительно облегчает их идентификацию в отягощенных семьях. Индекс гетерозиготности таких полиаллельных мини- и микросателлит-ных систем нередко превышает 0,8. Их применение позволяет маркиро­вать, т. е. сделать информативными для ДНК-диагностики, практически все семьи высокого риска при условии наличия больного ребенка или доступности для молекулярного анализа его патанатомиче-ского материала.
Изучение полиморфных маркеров у больного и его родителей и вы­яснение аллельной природы молекулярного маркера, так называемое «определение фазы сцепления» , составляет основу для даль­нейшей диагностики косвенными методами [Евграфов О.В., Макаров В.Б., 1987]. Применение косвенных методов молекулярной диагностики предусматривает также в качестве обязательного предварительного этапа исследование частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анализируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носителей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и не­равновесности по сцеплению между маркерными сайтами и мутантными аллелями гена. Такие исследования проводятся с помощью методов блот-гибридизации по Саузерну либо ПЦР. В первом случае в распоряжении исследователя должны быть соответствующие ДНК-зонды, во втором - должны быть известны нуклеотидные последовательности районов ДНК, включающие соответствующие полиморфные сайты, для выбора олигопраймеров