ГРУППЫ РИСКА. ПОИСК ГЕТЕРОЗИГОТНЫХ НОСИТЕЛЕЙ МУТАЦИЙ

Как следует из изложенного выше, точная диагностика в сочетании с детальным анализом типа наследования того или иного заболевания имеет определяющее значение для формирования групп риска, то есть отбора семей, в которых вероятность рождения больных детей повышена. Прежде всего это те семьи, где уже есть или был ребенок, страдающий каким-либо моногенным наследственным заболеванием. Для ауто-сомно-рецессивных болезней с большой долей вероятности можно считать, что оба родителя этого ребенка являются гетерозиготными носителями мутантных аллелей соответствующего гена, и риск повторного рождения больного ребенка в такой семье составляет 25%, независимо от исхода предыдущих родов. Поэтому в таких случаях рекомендуется обязательная пренатальная диагностика плода при каждой последующей беременности.
Для сцепленных с полом заболеваний важной практической задачей является выявление случаев спонтанного возникновения мутаций в ро­дительском поколении. Для таких распространенных заболеваний, как миодистрофия Дюшенна и гемофилия А, почти треть всех случаев имеет спонтанное происхождение. При этом мутации гена дистрофина, как правило, возникают в оогенезе, то есть у матери, а мутации гена фактора VIII, обычно, появляются во время сперматогенеза у деда больного ре­бенка. В отличие от тех семей, в которых мать гетерозиготна, вероятность повторного рождения больного ребенка в семьях со спонтанной мутацией не превышает среднепопуляционной частоты, и потому нет необходимости проводить пренатальную диагностику плода при последующих беременностях. Специального рассмотрения в этой связи заслуживает, однако, вопрос гонадного мозаицизма, т. е. наличия в гонадах матери генетически нормальных и мутантных ооцитов. Особенно велик риск такого состояния в случае миодистрофии Дюшенна. Го­надный мозацизм в силу своей органной специфики достаточно трудно доказать или опровергнуть. Между тем, считается что 6,7 % спорадиче­ских случаев миодистрофии Дюшенна обусловлены гонадным мозаи-цизмом у матери [Essen A.J. et al., 1992].

Разработка молекулярных методов диагностики болезней

Разработка молекулярных методов диагностики болезней, вызванных мутациями в митохондриальных генах, как показывают исследования последних лет [McKusick V.A., 1994], приобретает особое значение. Как правило, в основе различных «митохондриальных» болезней лежат на­рушения в системе окислительного фосфорилирования. Поскольку не­которые ткани обладают повышенной чувствительностью к подобным  нарушениям, сходная клиническая картина заболеваний может наблю­даться вследствие мутаций разных митохондриальных генов. Наследо­вание таких болезней значительно отличается от менделевского типа, в первую очередь, из-за материнского характера наследования митохонд­рий, наличия в зиготе и, соответственно, во всех клетках организма большого числа копий митохондриальных хромосом, из-за особенностей сегрегации этих хромосом при делении клеток и, наконец, из-за тех количественных и качественных изменений в митохондриальной ДНК, которые сопровождают процессы онтогенетической дифференцировки клеток и старения организма.
Для всех «митохондриальных» болезней характерен материнский тип наследования и присутствие мутантных аллелей только в части хромосом (так называемая гетероплазмия), доля которых может варьировать в разных тканях. Как правило, существует определенное пороговое значе­ние доли мутантных хромосом, превышение которого ведет к появлению и прогрессированию заболевания. Сокращение числа митохондрий, происходящее в норме при старении, может способствовать увеличению доли мутантных хромосом в определенных тканях и тем самым быть причиной болезни. Не случайно поэтому для многих «митохондриальных болезней» характерно позднее начало. В силу функциональных осо­бенностей митохондриальных генов часто наблюдается кумулятивный эффект двух и более мутаций, локализованных в разных генах. Важным представляется также то обстоятельство, что в митохондриальных генах OXPHOS-комплекса частота возникновения мутаций выше, чем в ядер­ных генах, кодирующих субъединицы окислительного фосфорилирова-ния [McKusick V.A., 1994].

При доминантном наследовании

При доминантном наследовании для развития болезни достаточно одного мутантного аллеля. Такие больные с вероятностью 50% рождаются в семьях, где один из родителей болен. Очень редко больные дети с доминантным типом наследования могут родиться и у здоровых роди­телей в результате мутирования одной из гамет. Однако вероятность повторного рождения больного ребенка в такой семье такая же, как и для популяции в целом. Пренатальная диагностика доминантных болезней проводится достаточно редко по ряду причин. Во-первых, такие болезни составляют относительно небольшой процент среди всех моногенных заболеваний. Во-вторых, тяжелые болезни, сопровождающиеся летальным исходом в раннем возрасте или приводящие к бесплодию, не передаются по наследству, а появляются каждый раз заново вследствие мутации при созревании гамет. Необходимость же предотвращения рождения больных, которые не только доживают до репродуктивного возраста, но и способны оставить потомство, является вопросом дискуссионным. Проведение пренатальной диагностики таких заболеваний принимается с учетом многих конкретных обстоятельств. Актуальность этой проблемы стала особенно очевидной в последние годы, когда была открыта многочисленная группа доминантных нейродегенеративных заболеваний которые проявляются сравнительно поздно, нередко уже в репродуктивном возрасте, тяжело протекают и по сути не имеют сколько-нибудь реальной терапии. Для таких заболеваний первостепенное значение приобретают методы досимптоматической диагностики с использованием анализа ДНК.
Значительно больше распространены моногенные болезни с частич­ным доминированием и неполной пенетрантностью. Для подобных забо­леваний риск рождения больного ребенка в отягощенной семье зависит от конкретных значений этих параметров, которые, в свою очередь, определяются молекулярными механизмами, лежащими в основе формирования такого рода отклонений от менделевского типа наследования.

Y-хромосома

Y-хромосома содержит очень мало генов, большинство из которых (около 10) картировано в так называемой псевдоаутосомной области короткого плеча, гомологичной таковой на коротком плече X-хромосомы. Важнейшим истинным геном Y-хромосомы, т. е. геном, представленным только на этой хромосоме, является ген SRY (Yp21.1), детерминирующий развитие пола по мужскому типу. Мутации этого регуляторного гена приводят к нарушениям половой дифференцировки (XY-женщины), а его перенос вследствие ошибок рекомбинации псев-доаутосомных районов на короткое плечо Х-хромосомы обусловливает синдром реверсии пола - Sex reverse (ХХ-мужчины) [McElreavey К. et al., 1993]. Практически важно, что присутствие даже небольшого околоцен-тромерного фрагмента длинного плеча Y-хромосомы при кариотипе XX является безусловным показанием для удаления зачатков гонад у таких индивидуумов в связи с высокой вероятностью экспрессии гена Gba, ведущего к их злокачественному перерождению - гонадобластоме [Giquel С. et al., 1992]. В отличие от Y-хромосомы, большая по размеру Х-хромосома человека несет до 5% всех структурных генов, многие из которых уже идентифицированы.
Все рецессивные аллели Х-хромосомы у мальчиков проявляются, так как находятся в гемизиготном состоянии. Девочки могут болеть в том случае, если они гомозиготны по мутации. Такая возможность может осуществиться в семье, где болен их отец, а мать является носительницей мутации и передала дочери свой мутантный аллель. Если отец больной девочки здоров, можно предполагать, что мутация возникла в той его гамете, которая участвовала в оплодотворении. Х-сцепленные заболевания у девочек (миодистрофия Дюшенна, гемофилия А) могут быть следствием сочетанного проявления мутации этих генов у одного из родителей и делеции соответствующих фрагментов хромосом у другого. В этих редких случаях у девочек, как и у мальчиков, мутации X-сцепленных генов будут находиться в гемизиготном состоянии.

ДНК-ДИАГНОСТИКА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ НАСЛЕДОВАНИЯ

Напомним, что значительное число моногенных заболеваний насле­дуется по рецессивному типу. Это значит, что при аутосомной локали­зации соответствующего гена болеют только гомозиготные носители мутаций. Гетерозиготы клинически здоровы, но с равной вероятностью передают своим детям мутантный или нормальный варианты гена. Таким образом, на протяжении длительного времени мутация в скрытом виде может передаваться из поколения в поколение. При аутосомно-рецессивном типе наследования в родословных тяжелых больных, кото­рые либо не доживают до репродуктивного возраста, либо имеют резко сниженные потенции к размножению, редко удается выявить больных родственников, особенно по восходящей линии. Исключение составляют семьи с повышенным уровнем инбридинга, который возникает либо за счет высокой частоты близкородственных браков, либо за счет вступ­ления в брак людей из одинаковых изолированных популяций ограни­ченной численности. Больные дети с вероятностью 25% рождаются в тех семьях, где оба родителя являются гетерозиготными носителями мутаций одного и того же гена. Возможно также рождение больного ребенка в такой семье, где только один из супругов несет мутацию, а вторая мутация возникла в гамете его партнера в момент, предшествующий оплодотворению. Доля таких семей в общей группе риска относительно невелика, а риск повторного рождения в них больного ребенка не превышает общей частоты спонтанного возникновения мутаций в данном гене. Для болезней, сцепленных с полом, то есть контролируемых генами, локализованными в Х-хромосоме, характерно то, что болеют пре­имущественно мальчики, тогда как носителями являются девочки.

Изучение полиморфных маркеров

Все эти недостатки могут быть устранены при использовании в каче­стве молекулярных маркеров высокополиморфных тандемно повто­ряющихся коротких три- и тетрамерных повторов (STR). Для многих генов найдены уникальные паттерны полиморфных аллелей, отличающихся по числу «коровых» единиц повторяющихся последова­тельностей нуклеотидов. Такие «количественные» полиморфизмы , как уже упоминалось, очень широко распространены по всему геному и присутствуют в интронных и фланкирующих областях многих генов. Появление в конце 1994 г. 0,7 сМ-ой карты генома человека, по­строенной на базе высокололиморфных динуклеотидных (С-А)п-повто-ров, сделало реальным маркирование практически любого картирован­ного гена. Особенную диагностическую ценность представляют внутригенные маркеры, для которых резко снижена вероятность кроссинговера с мутантными аллелями гена, а следовательно, особенно высока точность диагностики. Кроме того, как оказалось, многие внутригенные полиморфные короткие тандемные повторы обнаруживают сильное не­равновесие по сцеплению с определенными мутантными аллелями гена, что значительно облегчает их идентификацию в отягощенных семьях. Индекс гетерозиготности таких полиаллельных мини- и микросателлит-ных систем нередко превышает 0,8. Их применение позволяет маркиро­вать, т. е. сделать информативными для ДНК-диагностики, практически все семьи высокого риска при условии наличия больного ребенка или доступности для молекулярного анализа его патанатомиче-ского материала.
Изучение полиморфных маркеров у больного и его родителей и вы­яснение аллельной природы молекулярного маркера, так называемое «определение фазы сцепления» , составляет основу для даль­нейшей диагностики косвенными методами [Евграфов О.В., Макаров В.Б., 1987]. Применение косвенных методов молекулярной диагностики предусматривает также в качестве обязательного предварительного этапа исследование частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анализируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носителей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и не­равновесности по сцеплению между маркерными сайтами и мутантными аллелями гена. Такие исследования проводятся с помощью методов блот-гибридизации по Саузерну либо ПЦР. В первом случае в распоряжении исследователя должны быть соответствующие ДНК-зонды, во втором - должны быть известны нуклеотидные последовательности районов ДНК, включающие соответствующие полиморфные сайты, для выбора олигопраймеров

Косвенные методы молекулярной диагностики

Более того, косвенные методы молекулярной диагностики пригодны даже для тех болезней, гены которых еще не идентифицированы и мута­ции неизвестны. Единственным и непременным условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрикции либо коротких тандемных повторов, типа STR, находящихся в непосредственной близости от му-тантного гена или, что еще лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих полиморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена и проследить их передачу потомству (см. главу 3). Ранние иследования непрямым методом проводились почти исключительно с использованием полиморфных сайтов рестрикции - двухаллельной сис­темы, информативная емкость которой не превышает 50%, а реальная частота гетерозигот по данному признаку в популяции оказывается су­щественно ниже 0,5. Следовательно, в лучшем случае только половина гетерозиготных носителей наследственного заболевания, вызванного рецессивной мутацией какого-нибудь гена, могла быть доступна непря­мой молекулярной диагностике с использованием одного полиморфного сайта рестрикции. Повышение информативности в случае ПДРФ-анализа могло быть достигнуто только путем увеличения числа полиморфных сайтов. Как правило, для диагностики необходим не один, а 3 -4 полиморфных сайта, что далеко не во всех случаях возможно. Многие из полиморфных сайтов локализованы вне генов на расстояниях, при которых кроссинговер может в заметном проценте случаев исказить результаты диагностики. Кроме того, практическое использование рест-рикционных сайтов зачастую затруднено из-за отсутствия или большой стоимости соответствующих эндонуклеазных рестриктаз.

Преимущество прямого метода

Главное преимущество прямого метода - это высокая, доходящая до 100%, точность диагностики и отсутствие необходимости анализа всей семьи на предмет ее информативности (см. ниже). Последнее обстоя­тельство особенно важно для проведения пренатальной диагностики тяжелых, зачастую летальных наследственных болезней (муковисци-доза, миодистрофии Дюшенна, гемофилии А и др.). Такие семьи нередко обращаются за медико-генетической помощью уже после того, как больной ребенок умер. Так, по нашим наблюдениям, до 80% семей с высоким риском муковисцидоза обращаются по поводу необходимости дородовой диагностики уже после смерти больного ребенка [Baranov V.S. et al., 1992].
Однако существует огромное количество наследственных болезней, для которых мутации не описаны либо не найдено мажорных мутаций в исследуемых популяциях. Даже во всех тех случаях, когда имеются ма­жорные мутации, наряду с ними описаны многочисленные редко встре­чающиеся (вплоть до единичных случаев) так называемые минорные мутации. Кроме того, всегда сохраняется возможность присутствия у пробанда неизвестных мутаций, а клонирование гена больного человека для целей прямого секвенирования, даже ограниченного только смысло­вой его частью - кДНК, далеко не всегда возможно в силу очевидных финансовых и временных ограничений такого подхода. Эти трудности успешно преодолеваются благодаря наличию непрямых (косвенных) методов молекулярной диагностики.
Этот исторически более ранний подход основан на использовании сцепленных с геном полиморфных маркеров, с помощью которых про­водится идентификация мутантных хромосом (точнее хромосом, несущих мутантный ген) в семьях высокого риска, т. е. у родителей больного и его ближайших родственников. В настоящее время косвенные методы  молекулярной диагностики принципиально возможны практически для всех моногенных заболеваний с известной локализацией контролирую­щего гена, для каждого из которых уже разработана удобная система вне- и внутригенных полиморфных индексных маркеров.

ПРЯМЫЕ И КОСВЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

 
Локализация и клонирование последовательностей кДНК генов от­крывают принципиально новые возможности диагностики наследствен­ных заболеваний, основанные на исследовании мутантных аллелей у пациентов, членов их семей или у предполагаемых гетерозиготных но­сителей патологических мутаций. Это в равной мере относится и к пре-натальной диагностике, которая может быть проведена с использованием молекулярных методов анализа на самых ранних стадиях развития плода. Эти же подходы вполне приемлемы для диагностики до появления каких-либо клинических или биохимических симптомов бо­лезни (досимптоматическая диагностика), что позволяет выработать и начать рациональную тактику лечения (упреждающая терапия), а также эффективно выявлять гетерозиготных носителей в семьях высокого риска, что является важным фактором профилактики наследственных болезней. Решающими преимуществами молекулярной диагностики являются ее универсальность, возможность использовать для анализа любые ДНК-содержащие клетки или ткани, причем анализ может быть произведен на любых стадиях онтогенеза, начиная со стадии зиготы.
Принципиально различают прямую и непрямую ДНК-диагностику моногенных наследственных болезней. В общем случае использование прямых методов диагностики возможно лишь для клонированных генов с известной нуклеотидной последовательностью полноразмерной кДНК, при этом необходимо предварительное генотипирование мутантных аллелей у родителей. В случае прямой диагностики объектом молеку­лярного анализа является сам ген, точнее мутации этого гена, идентифи­кация которых и составляет основную задачу исследования. Такой подход особенно эффективен при наличии точной информации о природе, частоте и локализации наиболее распространенных (доминирующих по частоте) мутаций соответствующих генов, а также о наличии в них осо­бенно легко мутирующих «горячих» точек. К таковым относятся мутация delF508 и ряд других мутаций при муковисцидозе, делеционные мутации при миодистрофии Дюшенна, мутация R408W при фенилкето-нурии, инверсионная мутация при гемофилии А, протяженная делеция при адреногенитальном синдроме, экспансии триплетных повторов в случае «динамических» мутаций при синдроме ломкой Х-хромосомы и при ряде других нейродегенеративных заболеваний. Методы, используемые для направленного поиска этих мутаций, под­робно рассмотрены в главе 4. В ряде случаев (муковисцидоз, фенилке-тонурия, серповидно-клеточная анемия) эти методы удалось автомати­зировать, что позволяет одновременно тестировать сразу несколько (до 30 и более) различных мутаций. При этом появляется реальная возможность выявлять свыше 95 - 98% мутантных хромосом, что делает целе­сообразным и экономически оправданным скринирование всей популя­ции отдельных стран на выявление мутантных особей для последующей организации эффективных профилактических мероприятий, направлен­ных на предупреждение рождения больных детей. Подобные программы по муковисцидозу уже успешно проводятся в ряде стран Западной Ев­ропы (в Великобритании, Дании, Франции) и Северной Америки.

Использование экспрессионных библиотек

Использование экспрессионных библиотек для изоляции кодирующих последовательностей гена рассматривалось ранее. После секвенирования кДНК можно, исходя из генетического кода, про­гнозировать аминокислотный состав белка и произвести компьютерный поиск в банке данных гомологичных последовательностей в составе белков с уже известной структурой и функциями. Выявление родствен­ных белков, близких по своему полипептидному составу, значительно ускоряет и облегчает дальнейший молекулярный анализ функциониро­вания исследуемого белка в клетке. Аминокислотная последовательность белка позволяет прогнозировать его третичную структуру, иден­тифицировать домены, оценивать функциональную значимость целого белка и отдельных его компонентов. Не менее важным практическим следствием этих данных является также возможность получения антител к строго специфичным участкам белка. Для этого могут быть использо­ваны два подхода - биохимический и молекулярно-генетический. В пер­вом случае для иммунизации используют искусственно синтезированные полипептиды, которые пришивают к белковой молекуле-носителю (гаптену). Размеры таких полипептидов обычно не превышают 30 ами­нокислот - они не могут быть очень большими из-за высокой стоимости и трудоемкости синтеза длинных молекул. При втором подходе экзон-ные участки гена инсертируют в экспрессионный вектор в область, кодирующую селектируемый белок. В результате экспрессии такой конструкции получают слитый белок, в котором наряду с аминокис­лотной последовательностью селектируемого маркера содержится оп­ределенный фрагмент исследуемого белка. Эту химерную молекулу и используют для иммунизации животных и получения моновалентных или моноклональных антител. При наличии антител могут быть применены различные иммунологические подходы для анализа тканеспе-цифического и внутриклеточного распределения белка, исследования его модификаций, а также для получения нативного белка в препаративных количествах.

Три типа экспрессионных систем

Существует три типа экспрессионных систем - бактериальные, скон­струированные обычно на основе Е. coli, дрожжевые и экспрессионные культуры клеток млекопитающих. Каждая из этих систем имеет свои преимущества и недостатки. Бактериальные системы наиболее удобны для клонирования, обладают высоким уровнем экспрессии (до 1-2 г белка на литр культуры) и их используют обычно для производства большого количества чистого белка, необходимого для получения антител или для фармацевтических целей. Удобны также эти системы для введения изменений в различные районы полипептидной цепи путем сайт-направленного мутагенеза в нуклеотидной последовательности чуже­родной ДНК. Получение и исследование таких «мутантных» белков очень важно для оценки функциональной значимости различных участков белка.
Уровень экспрессии чужеродных белков в дрожжевых клетках вдвое, а в клетках млекопитающих - в десятки раз ниже, чем в бактериальных. Однако в бактериальных клетках отсутствуют ферментативные системы, обеспечивающие процессинг эукариотических белков. Поэтому эука-риотические системы удобнее использовать для изучения посттрансля­ционных модификаций белка - гликозилирования, т. е. присоединения к полипептидной цепи углеводных остатков; скручивания белка с образо­ванием третичной структуры, часто за счет возникновения дисульфид-ных связей; и N-концевых модификаций, стабилизирующих структуру белка. В ДНК-экспрессионных системах может быть синтезировано дос­таточно много белка, чтобы получить его в кристаллической форме и исследовать пространственную структуру и функциональное назначение отдельных доменов [Хэймс Б., Хиггинс С, 1987].

НАЛИЗ ТРАНСЛЯЦИИ. ДНК-ЭКСПРЕССИОННЫЕ СИСТЕМЫ

Традиционные методы анализа регуляции трансляции и посттранс­ляционных модификаций белков основаны на использовании модельных систем, представляющих собой цитоплазматические, свободные от мРНК, безъядерные экстракты клеток, содержащие рибосомальный аппарат, транспортные РНК, набор аминокислот и ферментов, необходимых для трансляции и процессинга белков [Хэймс Б., Хиггинс С, 1987; Клеменс М., 1987]. После добавления к такой системе специфической мРНК происходит синтез соответствующей полипептидной цепи in vitro. При введении меченых аминокислот в систему вновь синтезированные белки после электрофоретической очистки могут быть идентифицированы путем радиоавтографии либо иммунологическими методами при наличии соответствующих антител [Клеменс М., 1987]. Однако для зна­чительного числа моногенных наследственных заболеваний первичный биохимический дефект неизвестен, а следовательно, не идентифициро­ваны и мРНК-транскрипты. Биохимическое изучение многих белков затруднено из-за их минорного содержания и отсутствия эффективных методов выделения и очистки. Последнее обстоятельство в значительной мере относится к нерастворимым белкам, ассоциированным с мем­бранными структурами клеток.
ДНК-экспрессионные системы, то есть клеточные культуры, синте­зирующие чужеродные белки, являются очень мощным средством ана­лиза структуры, функции и синтеза белков [Sambrook J. et al., 1989]. Такие системы конструируют на основе экспрессионных векторов, содержащих в своем составе сильные промоторы и регуляторные последовательности, обеспечивающие высокий, но в то же время регулируемый уровень экспрессии. Кодирующие последовательности чужеродных генов инсертируют (вставляют) с помощью соответствующих генно-инже­нерных приемов в область действия этих промоторов. Конечно, такие системы должны содержать и трансляционные сигналы, в частности, сайты связывания рибосом, обеспечивающие работу рибосомального аппарата клеток хозяина. В некоторых случаях экспрессионные векторы вводят в мутантные по протеазным генам клеточные культуры, с тем чтобы предотвратить деградацию чужеродных белков в клетках.

Матричная РНК

Матричная РНК является наиболее удобным объектом для изучения регуляции транскрипции генов и посттранскрипционных модификаций РНК. Тотальная клеточная РНК состоит на 90 - 95% из рибосомальных и транспортных РНК, тогда как доля транслируемых или poly(A)+ РНК  не превышает 5% [Льюин Б., 1987]. При этом концентрация РНК-транскриптов индивидуальных генов среди всех молекул мРНК в среднем колеблется в пределах от 0,01 до 0,001% [Гайцхоки B.C., 1978]. Поэтому для обнаружения индивидуальных типов мРНК должны использоваться высокочувствительные методы. Обычным методом идентификации мРНК на тканевом и клеточном уровнях является гибридизация in situ РНК- или ДНК-зондов с молекулами мРНК на гистологических срезах [Хаффнер Р., Уиллисон К., 1990]. В качестве ДНК-зондов используют клонированные последовательности кДНК и синтетические олигонуклео-тиды. После инкубации меченых зондов на цитологических препаратах с последующей тщательной отмывкой несвязавшихся молекул положение комплементарных РНК-последовательностей в клетках определяют ра­диоавтографическими либо в случае биотинового мечения - иммуноги-стохимическими методами. Оптимальные условия гибридизации дают возможность не только выявлять присутствие специфических мРНК, но и определять их внутриклеточную локализацию [Манк М., 1990; Хаффнер Р., Уиллисон К., 1990; Non-radioactive in situ..., 1992].
Анализ индивидуальных РНК включает изоляцию из тканей пула не­поврежденных биологически активных мРНК и идентификацию среди них специфических молекул путем использования различных вариантов ДНК-РНК-гибридизации. Для генов с высоким уровнем транскрипции могут быть пригодны дот- или слот-блоты (см. главу 1). Когда источником РНК служат клетки, которые не могут быть получены в большом количестве, используют цитоплазматический дот-блот. При этом целые клетки лизируют и фиксируют непосредственно на тех мембранах, на которых проводят гибридизацию. Значительно большей чувствительностью обладает так называемый Northern blot (нозерн-блот) - гибридизация с ДНК-зондами на фильтрах, предварительно сконцентрированных и фракционированных путем электрофореза молекул РНК [Sambrook J. et al., 1989]. Электрофорез проводят в агарозе с добавлением формальдегида, денатурирующего РНК. В этих условиях скорость продвижения молекул РНК через гель находится в логарифмической зависимости от длины последовательности, что позволяет точно определить размер РНК-транскрипта. Основная масса РНК на геле представлена в виде двух доминирующих бэндов, соответствующих двум типам рибосомаль-ной РНК - 28S и 18S. Все молекулы мРНК сконцентрированы в плохо различимой, слабо окрашенной области геля, в которой отдельные типы мРНК могут быть выявлены только путем гибридизации с соответст­вующими ДНК-зондами. Нозерн-блот имеет то преимущество, что при электрофорезе могут быть разделены молекулы РНК, дающие перекре­стную гибридизацию с ДНК-зондом. Кроме того, характер электрофоре-   
    137   
    тического разделения позволяет визуально оценить качество изолиро­ванной РНК. При очень низких концентрациях специфических мРНК или в тех случаях, когда ДНК-зонды дают перекрестную гибридизацию с другими компонентами (не мРНК), проводят обогащение изолированной тотальной РНК транслируемыми мРНК путем отбора на колонках фракций, содержащих поли-А-«хвосты». Для этого выделенную РНК пропускают через короткую колонку с пришитыми поли-Т-олигонуклеотидными последовательностями и высокой концентрацией солей в буферном растворе, так чтобы молекулы мРНК, содержащие поли-А-«хвосты», задерживались на колонке. При снижении концентра­ции солей в буфере происходит расплавление А-Т-дуплексов и высво­бождение молекул мРНК. Таким способом доля этих молекул в опреде­ленных солевых фракциях может быть увеличена на два порядка. Ко­нечно, поли-А-селекция применима в тех случаях, когда имеется доста­точно большое количество тотальной РНК. Другим методом для иссле­дования структуры РНК-транскриптов является S1-анализ. В этом случае ДНК-РНК-гибридизацию ведут в растворе, куда и добавляют S1-нуклеазу для переваривания однонитевых несвязавшихся молекул как ДНК, так и РНК, после чего проводят электрофоретическую очистку дуплексов, которые затем элюируют из геля для последующего анализа [Sambrook J. et al, 1989]. Этот метод очень удобен для анализа стартовых сайтов и З'-концов генов, для определения направления транскрипции и картирования нитронов.

АНАЛИЗ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНА

ИЗОЛЯЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ МРНК. ИСКУССТВЕННЫЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ
Регуляция экспрессии генов в цепочке ДНК - РНК - белок может осуществляться на различных молекулярных уровнях. В соответствии с этим исследования дифференциальной активности генов в разных типах  клеток и тканей включают оценку работы контролирующих элементов генов, анализ молекул РНК на всех этапах от появления первичного транскрипта до зрелой мРНК и изучение соответствующего белкового продукта, включая его процессинг (созревание), внутриклеточную лока­лизацию, тканеспецифическое распределение.
Исследования регуляторных цис-действующих элементов генома, та­ких как промоторы, энхансеры, участки ДНК, подавляющие транскрип­цию, являются составной частью анализа молекулярной структуры лю­бого гена. Идентификацию таких элементов проводят с использованием разнообразных современных методов молекулярной генетики. В частно­сти, последовательности ДНК в 5'-фланкирующей области гена, ответст­венные за тканеспецифическую индукцию генной активности, могут быть локализованы путем исследования транскрипции в различных линиях клеток при введении в них генов с искусственными делециями этих участков ДНК. Для оценки активности идентифицированных регулятор­ных последовательностей их сливают с чужеродными хорошо изучен­ными неиндуцибельными клонированными генами, так называемыми «репортерами». Такие генетические конструкции в составе векторных последовательностей вводят в культивируемые клетки эукариот и на­блюдают за изменением уровня экспрессии. В качестве «репортера» часто используют ген хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ-ген), который в естественных условиях экспрессируется только в клетках прокариот. Сам фермент (CAT) обладает высокой активностью, что по­зволяет не только легко обнаруживать ее минимальные количества в клетке, но и с высокой точностью проводить количественную оценку. Для повышения чувствительности анализ экспрессии химерных генов часто проводят в культуре фибробластов почек африканской зеленой мартышки (COS-клетки). Эти клетки модифицированы таким образом, что в них после трансфекции происходит амплификация копий сконст­руированных определенным образом эписом - внехромосомных генети­ческих конструкций (см. главу 10), что ведет к значительному усилению сигналов экспрессии введенных генов (трансгенов). Перенос генов (трансгеноз) может быть осуществлен и на уровне целого организма, в частности, зиготы. Полученные в результате подобных манипуляций трансгенные животные могут быть также использованы в качестве мо­дельной системы для анализа механизмов тканеспецифической активации генов in vivo.

Контроль генной активности

Контроль генной активности осуществляется за счет дифференци­альной транскрипции и процессинга РНК в клеточных ядрах, различной стабильности мРНК в цитоплазме, избирательной трансляции мРНК. Дифференциальная экспрессия генов, конечным результатом которой является синтез функционально активного белка, предполагает не только адекватную регуляцию генной активности, но и полноценность всех последующих этапов, включая сам белковый продукт, его устойчивость, способность к посттрансляционным модификациям, правильную локализацию и корректное взаимодействие с другими компонентами клетки. Решающее значение для успешного анализа всего этого сложного ком­плекса имеет выбор адекватных биологических моделей, поиск и целе­направленное конструирование которых представляет вполне самостоя­тельную научную задачу.
Наиболее доступными модельными системами для анализа экспрес­сии генов in vitro являются культуры клеток. Для клонирования, генно-инженерного манипулирования, направленного введения сайт-специ­фических мутаций, получения большого количества клонированных последовательностей ДНК, специфических молекул мРНК, а также бел­кового продукта гена обычно используют генетически хорошо изученные прокариотические системы [Хеймс Б., Хиггинс С, 1987]. Дтя исследования процессов трансляции, посттрансляционных модификаций белка, его внутриклеточной локализации и функционирования чаще используют культуры клеток эукариот и, в частности, специфические культуры клеток человека. Особая роль в изучении начальных этапов развития патологического процесса, обусловленного присутствием генных мутаций, а также в разработке терапевтических методов, включая генно-инженерную коррекцию метаболического дефекта, принадлежит культурам мутантных клеток. Это могут быть первичные или переви­ваемые культуры клеток, полученные из специфических тканей больного человека, либо выделенные из тканей линейных животных, служащих генетической моделью наследственного заболевания.
Идентификация гомологичных генов у экспериментальных животных во многих случаях значительно облегчает и ускоряет исследование функ­циональной активности нормальных и мугантных генов человека. Боль­шая роль в изучении молекулярных механизмов развития патологических процессов in vivo принадлежит генетическим линиям животных. Это мо­гут быть линии, полученные в результате отбора спонтанно возникших или индуцированных мутаций, а также искусственно сконструированные модели на базе трансгенных животных, в геном которых введен чужерод­ный ген или фрагмент ДНК. Рассмотрим основные экспериментальные подходы, используемые для анализа экспрессии генов.

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ. ВЫБОР АДЕКВАТНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ

Молекулярная идентификация гена, нарушение работы которого
приводит к развитию наследственного заболевания, создает предпосылки для дальнейшего более подробного анализа генетических и биохими­ческих основ патогенеза и разработки на этой основе наиболее эффек­тивных методов лечения. Начальные этапы решения поставленной задачи включают в себя исследование механизмов тканеспецифической экс­прессии и регуляции активности генов в нормальных клетках, оценку клинического выражения различных типов нарушений гена, выявление первичного биохимического дефекта, а также сопоставление молеку­лярных основ работы генов в нормальных и мутантных клетках.
Естественно, что в различных тканях организма экспрессируется не все, а лишь определенные группы генов. Исключение составляют лишь так называемые гены «домашнего хозяйства» (house-keeping genes), re-нопродукты которых обеспечивают жизнедеятельность всех типов клеток (см. главу 2). По весьма ориентировочным оценкам, в тканях млеко­питающих и человека работают в среднем около 2 - 3% всех генов, в клетках печени - основной биохимической лаборатории организма -около 5%, тогда как в клетках мозга - примерно 9 - 10% [Корочкин Л.И., 1987]. Это означает, что в различных соматических клетках эукариот транскрибируется от 5 до 20 тыс. генов [Льюин Б., 1987]. Значительная часть контролируемых ими белков необходима для обеспечения жизне­деятельности самих клеток. В процессе онтогенеза и клеточной диффе-ренцировки в разных тканях организма происходит избирательная акти­вация многих других специфических генов, что, в конечном итоге, обу­словливает значительные межклеточные различия в наборе белков и в скорости их синтеза.

Исследование спектров распределения мутаций

Исследование спектров распределения мутаций в различных популя­циях позволяет делать предположения относительно возможного проис­хождения таких повреждений и тех механизмов, которые лежат в основе их распространения среди населения.
Рассмотрим наиболее вероятные интерпретации различных вариантов распределения аллелей в популяциях. Мутации, представленные у единичных больных или в группе родственных индивидуумов и не имеющие специфической внутригенной локализации, по-видимому, яв­ляются следствием естественного мутационного процесса. Если в каких-то популяциях концентрация мутаций в различных генах повышена, ве­роятно, они находятся в зоне действия внешних неблагоприятных фак­торов, индуцирующих возникновение нарушений в структуре ДНК. В тех случаях, когда локализация и типы мутаций носят специфический характер, можно предполагать наличие особых молекулярных механизмов контроля повышенного уровня мутагенеза в определенных районах генома. Распространение специфических мутаций в изолированных по­пуляциях происходит за счет их ограниченного размера и повышенного уровня инбридинга (эффект родоначальника). Наконец, обнаружение градиентного распределения мутаций, превалирующих в различных, частично изолированных популяциях, позволяет предполагать селектив­ное преимущество гетерозиготных носителей мутаций на определенных этапах эволюционного развития. Таким образом, сопоставляя спектры распределения однотипных му­таций у жителей разных континентов, разных стран, у людей, принадле­жащих к различным расам и национальностям, можно определить сте­пень генетической близости между всеми этими группами и реконструи­ровать их филогенетические отношения [Cavalli-Sforza' L.L., Piazza A., 1993]. Одним из практических следствий этих исследований является возможность прогнозировать наиболее вероятные мутации в различных генах у пациентов разного этнического происхождения, что приводит к сужению спектра поиска специфических мутаций. Особый интерес в этом смысле представляют наиболее распространенные мутации (например, delF508 - при муковисцидозе; R408W - при фенилкетонурии и мн. др.). Для профилактики наследственных заболеваний необходима разработка эффективных и простых методов молекулярной диагностики таких мутаций как у больных, так и у гетерозиготных носителей с целью проведения скринирующих программ среди населения и выявления мак­симально возможного числа семей с повышенным риском рождения больного ребенка.

Возможность неравновесности по сцеплению

Однако специфические мутации могут получить значительно более широкое распространение в тех случаях, когда гетерозиготные особи имеют какие-либо селективные преимущества. Таким эффектом может обладать сама мутация, но более вероятна возможность неравновесности по сцеплению между этой мутацией и селективными аллелями дру­гого локуса. Гетерозиготы могут получить преимущество при изменении условий окружающей среды, в каких-то экстремальных ситуациях или среди определенных групп населения. Так, например, мутации, по­вышающие устойчивость организма к действию инфекционных агентов, могут получить широкое распространение в период массовых эпидемий. Одновременно повысится частота всех аллелей других локусов, находя­щихся в неравновесности по сцеплению с данной мутацией. Мутантные аллели, обеспечивающие селективное преимущество гетерозигот, стано­вятся преобладающими во многих популяциях, не полностью изолиро­ванных друг от друга. При этом наибольшая частота таких аллелей будет наблюдаться в районах, где влияние поддерживающего отбора было максимальным (например, в эпицентре эпидемии). По мере удаления от этого района концентрация таких мутантных аллелей будет уменьшаться, причем их распределение в разных популяциях будет коррелировать с характером миграции населения. Подобный характер распределения определенного мутантного аллеля в частично изолированных популяциях принято связывать с так называемым эффектом основателя или родо­начальника.

МЕХАНИЗМЫ ПОДДЕРЖАНИЯ И РАСПРОСТРАНЕНИЯ МУТАЦИЙ В ПОПУЛЯЦИЯХ

Частоты и характер распределения мутаций в популяциях зависят от многих факторов, главными из которых являются частоты мутагенеза и давление естественного отбора. Значительное влияние на этот процесс оказывают также структурные особенности популяций, такие как размеры, степень географической и этнической изолированности, величина инбридинга, характер миграции населения.
Для всех мутаций, возникающих за счет повышенного уровня спонтанного мутагенеза, характерны следующие особенности: неслу­чайный характер внутригенной локализации мутаций, сходство типов нарушений при отсутствии полной молекулярной идентичности между ними. В отличие от спонтанных мутаций, вызванных эндогенными причинами, для мутаций, индуцированных действием неблагоприятных факторов внешней среды, промышленными и сельскохозяйственными вредностями, ионизирующим облучением, химическими агентами и прочим, специфики в типах мутаций и в характере их локализации не наблюдается. В популяциях, находящихся в области действия таких неблагоприятных факторов, будет повышена частота мутаций в различных генах, однако спектр индуцированных мутаций будет дос­таточно разнообразным.
Рассмотрим теперь влияние отбора на процесс поддержания и рас­пространения мутаций в популяциях. Многие гены моногенных наслед­ственных заболеваний рецессивны, т. е. мутации в них в гетерозиготном состоянии не оказывают вредного влияния на жизнеспособность. По­этому после возникновения мутация может распространяться в популя­ции до определенной концентрации, практически не подвергаясь элими­нирующему действию естественного отбора. В дальнейшем частота этой мутации достигнет равновесного состояния и не будет повышаться за счет выщепления гомозиготных особей, жизнеспособность и репродуктивные качества которых резко снижены. При этом скорость элиминации мутации из популяции резко замедляется при снижении ее частоты, и практически после возникновения мутация может сохраняться в попу­ляции на протяжении многих десятков и даже сотен поколений. Различные мутации могут случайным образом получить большее распространение в изолированных популяциях или среди групп населения, отличающихся повышенным уровнем инбридинга. В целом, при отсутствии давления отбора по отношению к гетерозиготным особям общая концентрация мутантных аллелей в популяции определяется частотой их спонтанного возникновения, при этом пул мутаций будет состоять из большого количества разнообразных аллелей, каждый из которых будет представлен редкими или даже единичными случаями в различных популяциях.

Наличие тесно сцепленных с генами гомологичных последовательностей ДНК

Другим важным фактором эндогенного мутагенеза является наличие тесно сцепленных с генами гомологичных последовательностей ДНК (псевдогенов). В мейозе такая ситуация нередко приводит к неравной гомологичной рекомбинации и, как следствие этого, к генной конверсии, сопровождающейся структурными перестройками типа делеций, дупликаций и т.п. Подобный механизм мутаций, как оказалось, является доминирующим для гена 21-гидроксилазы [Morel Y., Miller W.L., 1991], а также для гена фактора VIII свертывания крови [Lakich D. et al, 1993]. Важная роль ошибок рекомбинации в этиологии структурных поломок гена особенно очевидна при анализе гена дистрофина, мутации которого ведут к миопатии Дюшенна. Известно, что в 60% случаев мутации этого гена представляют собой делеций, захватывающие один или несколько соседних экзонов. Известно также, что подавляющее большинство деле­ций сосредоточено в двух «горячих» районах этого гигантского по раз­мерам гена (2,2 млн п.о.), и при этом частота внутригенных рекомбина­ций почти в 4 раза больше, чем можно предполагать, исходя из его раз­меров [Oudet С. et al., 1992]. Любопытно отметить, что в одной из этих «горячих» точек (интрон 7) недавно обнаружен кластер транспозонопо-добных повторяющихся последовательностей. Истинный вклад мобиль­ных (транспозоноподобных) элементов типа Alu- и Line-повторов (см. главу 2) в возникновение генных мутаций до конца не выяснен. Имеются единичные наблюдения о реальном перемещении этих элементов по типу конверсии и их интеграции в структурные гены аденозиндезамина-зы, аполипопротеина С, факторов VIII и IX свертывания крови, кальмо-дулина [Vidaud D. et al., 1993].

Замены или утраты отдельных оснований в геномной ДНК

Замены или утраты отдельных оснований в геномной ДНК могут возникать в результате нарушения процессов репликации и репарации. Ошибки в ДНК-матрице, вызванные действием повреждающих внешних агентов либо спонтанной деградацией оснований, закрепляются в по­следующих циклах репликации. Основные типы спонтанной деградации включают потерю оснований и процесс дезаминирования. Особенно чувствительны к дезаминированию цитозиновые остатки. Установлено, что у позвоночных почти половина всех цитозиновых остатков в ДНК метилирована в 5-м положении. Процесс метилирования особенно часто захватывает области повторов 5'-CpG-3', расположенные как внутри генов, так и в их промоторных частях. При дезаминировании 5-метил-цитозин превращается в тимин. В цикле последующей репликации возникший в результате дезаминирования ошибочный вариант (T-G) может либо корригироваться в нормальный вариант (C-G), либо приводить к мутациям типа трансцизий: (T-G) или (С-А). Естественно, что гены, имеющие в своей структуре большой процент CpG-оснований, особенно часто подвергаются спонтанному мутированию типа трансцизий. В ча­стности, преобладание подобных точечных мутаций известно для генов факторов IX и VIII свертывания крови, для гена фенилкетонурии и других. Так, из 76 мутаций гена фактора IX в 21 случае найдены трансцизий CpG - TpG или СрА [Green P.M. et al., 1990]. Преобладание таких мутаций отмечено и в 22 CpG-дуплетах гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией [Abadie V. et al., 1989].

Наличие в первичной структуре ДНК прямых повторов

Как подробно рассмотрено в серии работ Д.Н. Купера и М. Кравчака [Cooper D.N., Krawczak M., 1990; 1991], наличие в первичной структуре ДНК прямых повторов, идентичных повторяющихся последовательностей, инвертированных повторов, шпилечных структур, квазипалин-дромных последовательностей и симметричных элементов генома (например, CTGAAGTC) нередко ведет к образованию петель при репликации ДНК вследствие скользящего нарушения спаривания (slipping mispairing) родительской и дочерней цепей ДНК. Эти новые структурные элементы ДНК либо уничтожаются ферментами системы репарации, что ведет к делениям, либо сохраняются и дублируются, что приводит к дупликациям и инсерциям; при этом возникшие изменения закрепляются при последующих раундах репликации. Авторы приходят к следующим выводам:

♦  возникновение подобных мутаций происходит не случайно, но за­висит от особенностей первичной структуры ДНК в месте пере­стройки;
♦  в основе структурных перестроек ДНК лежат ошибки репликации;
♦  принципиально сходные модели эндогенного мутагенеза характер­ны как для делений, так и для инсерций.
Считается, что именно механизм скользящего нарушения спаривания ответствен за мутации экспансии, приводящие к быстрому увеличению числа тринуклеотидных повторов и к нарушению работы соответствую­щих генов, а также за высокую изменчивость, наблюдаемую во многих местах локализации мини- и микросателлитных тандемных повторов.
Недавно показано, что повышенной эндогенной мутагенностью обла­дают вообще все последовательности ДНК, находящиеся в определенном конформационном состоянии, а именно: в состоянии изгиба (bent DNA) [Milot E. et al., 1992]. Известно, что такая конформационная структура ДНК свойствена промоторным частям генов, местам начала репликации (origins of replication), местам контакта хромосом с ядерным матриксом. Именно эти участки ДНК являются местами посадки ферменгъв топоизо-мераз, вовлеченных в процессы репликации, транскрипции, рекомбинации, в том числе, как оказалось, и в процесс негомологичной (незаконной -illegitimate) рекомбинации. Установлено, что именно негомологичная рекомбинация может приводить не только к внутригенным делециям, дупликациям и другим мутациям на молекулярном уровне, но и является одной из основных причин крупных структурных хромосомных перестроек типа транслокаций, инверсий и других.

ЭНДОГЕННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ МУТАЦИЙ

    Основную часть мутаций, ведущих к наследственным болезням, составляют точечные мутации, делеции и, в меньшей степени, инсер-ции и дупликации. При этом, как показывает детальный сравнительный анализ, частота, тип и локализация этих мутаций отнюдь не случайны и зависят от многих, пока еще не выясненных эндогенных ме­ханизмов мутагенеза. В пользу такого вывода свидетельствует уникальный характер спектра мутаций для каждого из многих десятков генов, первичная структура ДНК и типы мутаций которых уже хорошо изучены. Так, для многих структурных генов доминирующими по спектру и частоте являются точечные мутации (ген трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза, ген фенилаланингидроксилазы, ген фактора IX свертывания крови, Р-глобиновый ген и др.), тогда как для других - достаточно протяженные структурные перестройки типа делеций, дупликаций и инсерций (ген дистрофина, ген фактора VIII свертывания крови, ген 21-гидроксилазы). К структурным факторам, определяющим эндогенные механизмы мутагенеза, можно отнести:
♦  наличие прямых и обратных повторов и симметричных элементов вблизи места перестройки;
♦  высокую концентрацию CpG-динуклеотидов;
♦  наличие внегенных последовательностей ДНК, гомологичных фрагментам структурного гена;
♦  мобильные элементы генома.
Естественно, что реализация этих структурных факторов в те или иные типы мутаций возможна лишь в процессе репликации (для первых двух) и рекомбинации ДНК хромосом (для третьего фактора).

Частота возникновения спонтанных мутаций

Прямые исследования показали, что в большинстве случаев частота возникновения спонтанных мутаций в микросателлитных STR-сайтах варьирует в пределах от 0,1 до 0,45% на гамету, что должно учитываться при использовании этих маркеров в практической медицине. Частота мутирования в вариабельных (С-А)п-повторах, используемых в качестве индексных маркеров в Genethon-картах сцепления, составляет 0,05% на гамету. Показано, что для ряда VNTR-локусов (MSB2) частота мутирования достигает 0,7% на гамету. Для других локусов (Ml 7) обнаружено достоверное превышение скорости мутагенеза в зародышевых клетках по сравнению с соматическими. Для многих достаточно стабильных STR-локусов обнаружены существенные меж-популяционные различия по частоте аллелей, что позволяет использо­вать эту изменчивость для генетической характеристики отдельных популяций. В то же время другие STR-сайты значительно чаще под­вергаются спонтанному мутированию, что приводит к уравновешиванию паттерна аллелей и делает эти маркеры малопригодными для по-пуляционных исследований. Имеются данные, что в наиболее вариа­бельных STR-локусах частота спонтанных мутаций может достигать 5% на гамету за поколение [Jeffreys A.J. et al., 1988].

ЧАСТОТЫ СПОНТАННОГО МУТАГЕНЕЗА

Считается, что средняя частота спонтанного возникновения мутаций в структурных локусах человека колеблется в пределах от 10"5 до 10"6 на одну гамету за каждое поколение. Однако эта величина может значительно варьировать для разных генов, меняясь в пределах от КГ* для высокомутабиль-ных локусов до 10"" в наиболее устойчивых частях генома. Эти различия зависят от многих факторов и, в первую очередь, от характера мутационного повреждения, от механизма возникновения мутации и локализации нарушения. Большое значение также имеет сам ген, протяженность его кодирующих областей и те функции, которые выполняют контролируемые им молекулы в обеспечении жизнедеятельности клеток и всего организма в целом. Так, например, нарушение работы генов, продукция которых необходима на ранних стадиях эмбриогенеза, может приводить к гибели плода. Такие мутации трудны для диагностики, и в практической медицине мы чаще всего имеем дело только с теми мутациями, которые не проявляют летального эффекта на ранних стадиях эмбрионального развития. Тем не менее не ис­ключено, что ранние эмбриональные летали составляют немалый процент среди мутантных аллелей различных генов и вносят определенный вклад в снижение репродуктивной функции.
    Особого внимания заслуживает проблема мутирования в STR-сайтах и в VNTR-локусах, часто используемых в настоящее время для геномной дактилоскопии и молекулярной диагностики. Эти участки генома, изменчивость в которых обусловлена различиями в числе тандемных повторов, формально можно отнести к разряду высокомутабильных. Заметим сразу, однако, что прямое сопоставление темпов мутирования в кодирующих областях генома и в мини- и микросателлитных последова­тельностях ДНК, по-видимому, некорректно, так как физическая основа изменчивости, наблюдаемой в этих функционально и структурно разли­чающихся локусах, совершенно различна. Мутабильность в STR-сайтах обусловлена нестабильностью числа повторов, причем возникающие мутации затрагивают, как правило, лишь весьма ограниченное число кластерированных копий, чаще всего одну или две. Подобные тандем-ные повторы редко наблюдаются в смысловых последовательностях ДНК. Исключение составляют лишь мутации экспансии, но и для них характерны, во-первых, существование большого числа аллелей дикого типа, отличающихся друг от друга небольшим числом копий, и, во-вторых, значительные различия по длине повторяющегося участка между нормальными и мутантными вариантами гена. Кроме того, изменчивость в STR-сайтах в основе своей носит нейтральный характер, и потому темп мутирования в этих локусах не подвержен жесткому контролю со стороны естественного отбора.

Мутации в различных локусах

Мутации в различных локусах возникают, как правило, независимо друг от друга, и наличие неравновесности по сцеплению, по-видимому, отражает тот факт, что мутация в одном из локусов возникла в хромосоме, несущей определенный аллель другого локуса, и далее эта хромосома получила распространение в популяции. Неравновесность по сцеплению является очень важной популяционной характеристикой, позволяющей судить о порядке и примерном времени возникновения различных мутаций, а также оценивать возможные механизмы их поддержания в популяции. Обнаружение сильной неравиовесности по сцеплению между специфическими мутациями гена и определенными аллелями маркерных локусов имеет важное практическое значение. Часто наблюдается неравновесность по сцеплению между мутантными аллелями гена и одновременно несколькими маркерными локусами. В этом случае анализ маркерных гаплотипов, т. е. наборов аллелей различных локусов, локализованных в одной хромосоме, дает возможность с высокой степе­нью вероятности оценивать характер мутационного повреждения и про­слеживать его наследование в семье больного.

По­нятие неравновесности по сцеплению

Как мы уже упоминали, частыми моногенными наследственными за­болеваниями считаются такие, при которых один больной ребенок встречается среди 2000 - 10 000 новорожденных, т. е. q2 колеблется в пределах 720оо - 'Ло ооо- Соответственно, частота мутаций q, в этих генах составляет от 0,5 до 2,5% и доля гетерозиготных носителей - 2pq - дос­тигает 1 - 5%. Для более редких заболеваний частоты гетерозигот не превышают десятых долей процента. Тем ие менее, если учесть, что об­щее количество различных моногенных заболеваний составляет около 5000 нозологии, оказывается, что в среднем каждый человек является носителем мутантных аллелей примерно десяти генов. В общем случае набор эти генов различен у разных людей, и только в тех семьях, где оба родителя являются носителями мутаций одного и того же гена, появляется 25% риск рождения больного ребенка.
До сих пор мы рассматривали изменчивость в одном локусе - А. По­нятие неравновесности по сцеплению определяет отношения между из­менчивостью в двух локусах - А и В. Ситуация здесь может быть двоякой. Если изменчивость в этих локусах независима, то аллели двух ло-кусов встречаются в популяции в случайных комбинациях. Однако, если аллели различных локусов в одних комбинациях встречаются чаще, чем в других, то говорят, что существует неравновесность по сцеплению. Количественно эта связь оценивается с помощью детерминанта нерав­новесности по сцеплению - d. Рассмотрим, чему равен детерминант не­равновесности по сцеплению в двухлокусной двухаллельной системе. Пусть Рщп и R„m, где п=1,2 и ш=1,2, частоты четырех возможных в этом случае типов гамет - AiBb А2В2, А|В2, A2Bi, a Pn и Rn, - частоты аллелей локусов А и В, соответственно. Если сочетания аллелей в гаметах слу­чайны, то теоретически ожидаемые частоты гамет четырех типов равны произведению частот входящих в эти гаметы аллелей, т. е. Pnm=PnxRm. В этом случае произведение частот двух типов гамет (AiB| и А2В2), нахо­дящихся в состоянии «притяжения», равно произведению частот гамет в состоянии «отталкивания» (А,В2 и А2В|), т. е. РцХР22 = PiXP2xR!xR2 = Pi2xP2[. Однако, если сочетания аллелей в гаметах не случайны, то эти произведения различны. Их разность служит мерой неравновесности по сцеплению - d. Итак d = |РцХР22 - Р|2хР2)|. При отсутствии неравновесности по сцеплению d = 0. Верхняя граница d = 0,25. Максимальная не­равновесность по сцеплению достигается при полном отсутствии двух типов гамет, находящихся либо в состоянии «притяжения», либо в состоянии «отталкивания» при одновременном равенстве частот остав­шихся двух типов гамет.

ПОЛИМОРФИЗМ. НЕРАВНОВЕСНОСТЬ ПО СЦЕПЛЕНИЮ

Молекулярная идентификация мутантных аллелей и разработка эф­фективных методов их диагностики у больных и у гетерозиготных носи­телей являются той экспериментальной базой, которая позволяет иссле­довать распространенность мутаций в различных этнических группах и популяциях. Одновременно возможен анализ сцепления мутантных ал­лелей с другими генетическими маркерами и оценка на этой основе предполагаемых механизмов возникновения и поддержания в популяциях наблюдаемого уровня изменчивости. Но прежде чем перейти к опи­санию основных целей и методов популяционного анализа мутаций оп­ределим более точно два основных понятия, часто используемых при проведении подобных исследований - понятия полиморфизма и нерав­новесности по сцеплению.
Генетическая изменчивость локуса в определенной популяции изме­ряется уровнем полиморфизма, и количественным выражением этой меры служат частоты аллелей. В однолокусной двухаллельной системе частоты двух вариантов аллелей А1 и А2 обозначаются буквами р и q, соответственно, и р + q = 1. Когда мы говорим, что в популяции сущест­вует полиморфизм по мутации, это значит, что ее частота выше опреде­ленного выбранного в соответствии с какими-то причинами условного уровня, чаще всего выше 5%. Высокополиморфными считаются локусы с близкими значениями частот аллелей. В больших популяциях со слу­чайным характером скрещивания, т. е. в панмиктических популяциях, действует закон Харди-Вайнберга, согласно которому частоты гомози­готных особей в популяции равны р2 и q2, соответственно, а доля гетеро-зигот равна 2pq. Таким образом, в двухаллельной модели частота гете-розигот в популяции по полиморфным локусам составляет 10% и более, а по высокополиморфным локусам может достигать 50%. Если число аллелей в локусе больше двух, общая частота гетерозигот в популяции равна 1 - (pi2+P22+.-.+pn2)) где р^ - частота аллеля Ак, к = 1, 2, ... п и pi+p2+...+pn=l. При этом доля гетерозигот в популяции возрастает с уве­личением числа аллелей и достигает максимального значения в каждой группе из п аллелей при равенстве их частот. Таким образом, при увели­чении числа аллелей, встречающихся с равными вероятностями, частота гетерозигот в популяции будет стремиться к единице, т. е. подавляющее число особей в популяции будут гетерозиготными по данному локусу. Такая ситуация характерна для высокополиморфных микросателлитных повторов, в частности STR, что и делает их наряду с другими преиму­ществами наиболее удобными генетическими маркерами.

Методы выявления мутаций

Итак, методы выявления мутаций довольно разнообразны и постоянно совершенствуются. В первую очередь, молекулярному анализу подверга­ют те гены, повреждения которых сопровождаются развитием наиболее частых заболеваний. Исследования проводят либо в семьях высокого рис­ка, где уже имеются больные с тем или иным моногенным заболеванием с целью выявления гетерозиготных носителей, либо непосредственно в по­пуляциях, где имеется большая выборка больных и можно предполагать высокую частоту гетерозиготных носителей мутаций. При этом выбор конкретных схем идентификации мутантных аллелей зачастую определя­ется диагностическими возможностями лабораторий и стоимостью анали­зов. Особое внимание уделяют поиску тех аллелей, которые встречаются в популяциях с высокой частотой. Именно для таких мутаций разрабатыва­ют более простые и эффективные методы молекулярной диагностики, позюляющие тестировать больных и проводить скрининг гетерозигот среди их родственников или среди определенных групп населения.
Важнейшей характеристикой мутантного аллеля является его корреля­ция с тяжестью течения заболевания, т. е. фенотипическое выражение му­тации в гомозиготном и в гетерозиготном состояниях, а также в компаун­де с другими мутантными аллелями того же гена. Для многих моногенных болезней обнаружено большое число аллелей, которые по своему клини­ческому проявлению могут быть подразделены на различные группы: от очень мягких, оказывающих незначительный повреждающий эффект, до летальных или полулетальных, обусловливающих смерть пациентов в раннем возрасте. Таким образом, молекулярная диагностика мутаций мо­жет иметь определяющее значение для прогнозирования развития заболе­вания и выбора адекватной тактики лечения. Подобные скринирующие программы в настоящее время разработаны и успешно осуществляются во многих странах для таких распространенных заболеваний, как серповид­но-клеточная анемия, муковисцидоз [Hubert R. et al., 1994]. Реализация этих программ наряду с большой медицинской пользой приносит и массу социальных проблем, некоторые из которых будут рассмотрены ниже.

Предварительная иммобилизация мутантных и нормальных ASO-зондов

Предварительную иммобилизацию мутантных и нормальных ASO-зондов на мембранах осуществляют за счет присоединения гомополимерных Т-хвостов с дезоксирибонуклеотидтрансферазой на конце. При этом олигонуклеотидные последовательности остаются свободными и могут участвовать в гибридизации с мечеными амплифицированными фрагмен­тами ДНК. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК радиоавтографи­ческие или цветные пятна на фильтрах становятся заметными только в местах локализации олигонуклеотидов, полностью комплементарных тес­тируемой геномной ДНК. Реакцию обычно проводят в присутствии ионов тетраалкиламмония, уменьшающих зависимость температуры плавления от композиции оснований. Это позволяет использовать одинаковые усло­вия гибридизации для различных олигонуклеотидов, т. е. вести поиск сразу нескольких типов мутаций, локализованных в одном и том же экзоне гена. Данный метод положен в основу разработки специальных систем, предназначенных для одновременной детекции наиболее распространен­ных мутаций в исследуемом гене. Система представляет собой ленточный фильтр (стрип) с нанесенными пятнами олигопраймеров, каждый из кото­рых соответствует определенной мутации. Стрип помещают в раствор со смесью тех меченых амплифицнрованных экзонов, которые могут содер­жать тестируемые мутантные аллели и создают условия для аллель-специфической гибридизации. Таким способом сканируют одновременно 42 мутации, ответственные за серповидно-клеточную анемию, 34 мутации -при муковисцидозе [Chebab F.F., 1993].
Очень простой метод обнаружения и идентификации описанных ранее мутаций в амплифицированных фрагментах ДНК основан на анализе ха­рактера электрофоретического разделения продуктов ПЦР в MDE-гидросвязывающих гелях в присутствии высоких концентраций мочевины. Эти гели способствуют формированию гетеродуплексов в процессе электрофореза, причем расположение дуплексов очень специфично для различных мутантных аллелей, локализованных в одном и том же ампли-фицированном фрагменте. Это позволяет не только выявлять, но с высокой степенью вероятности идентифицировать известные мутации. В мультиплексном варианте методики возможен одновременный поиск мутаций в нескольких амплифицированных фрагментах. Простота и высокая скорость анализа способствуют разработке на основе разделения в MDE-гелях схем максимальной автоматизации процесса поиска и идентификации известных мутаций у пациентов и гетерозиготных носителей мутаций.

Методо детекции замен оснований

Универсальным методом детекции замен оснований является метод аллель-специфических олигонуклеотидов - ASO, который включает ам­плификацию фрагментов ДНК и последующую дот- или слот-гибрндизацию с мечеными аллель-специфическими олигонуклеотидами [Reiss J., 1991]. Для этого синтезируют два типа олигонуклеотидных последовательностей обычно размером 19 п.о., в которых мутантный сайт занимает центральное положение. Каждый из этих олигонуклеотидных зондов комплементарен нормальному или мутантному вариантам ДНК, соответственно. Условия гибридизации подбирают таким образом, чтобы дуплексы образовывались только при полной комплементарное™ гибридных пар. В этих условиях амплифицированные фрагменты ДНК без мутации будут гибрнднзоваться только с нормальным зондом, ДНК гомозигот по мутации - только с мутантным и ДНК гете-розигот - с обоими олигонуклеотидамн (рис. 4.10). Для уменьшения перекрестной аллель-специфической гибридизации в реакционную смесь добавляют 30-кратный избыток конкурентного немеченого олиго-нуклеотндного ДНК-зонда. Разработаны удобные модификации метода ASO с использованием аллель-специфических ДНК-зондов, меченных биотином или пероксидазой хрена [Лебедева И.В. и др., 1994].
Наиболее быстрым, экономичным и удобным методом сканирования точечных мутаций является модифицированный вариант ASO, так назы­ваемая гибридизационная система обратного дот-блота (reverse dot-blot hybridisation system) [Saiki R.K. et al., 1989]. Метод позволяет одновре­менно скринировать сразу много точечных мутаций и доступен автома­тизации [Chebab F.F., 1993]. В этом случае проводят гибридизацию ме­ченых продуктов ПЦР, обычно представляющих собой отдельные экзо-ны, с фиксированными на нейлоновых фильтрах аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами (ASO).

Методы детекции состояния гена

Таким же преимуществом обладают и методы детекции состояния гена, основанные на лигировании синтетических олигонуклеотидных зондов - OLA (oligonucleotide ligation assay). При проведении этих реак­ций специфические ДНК- или РНК-последовательности исследуют путем использования их в качестве матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотидных зондов [Landegren U.N., 1993]. ДНК-зонды для лигирования подбирают таким образом, чтобы они были полностью комплементарны нормальному фрагменту ДНК в области локализации мутации, причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке двух праймеров. Обычно в один из зондов вводят радиоактивную или флюоресцентную метку, а другой метят биотином. После гибридизации при строго стандартных условиях синтезированные олигонуклеотидные последовательности сшивают ДНК-лигазами из термофильных микро­организмов. Такие ферменты работают при высоких температурах и сохраняют свою активность в условиях, необходимых для проведения денатурации молекул ДНК. При наличии мутации в тестируемой молекуле ДНК на конце одного из зондов образуется сайт некомплементар­ного спаривания, непосредственно примыкающий к месту лигирования. Наличие терминального неспаренного основания в смежно расположен­ных последовательностях ДНК-зондов резко снижает скорость лигиро­вания, и при определенных условиях проведения реакции сшивки между зондами в этом случае не происходит. Метод включает несколько по­следовательных циклов гибридизации, лигирования и денатурации. На­чиная со второго цикла, матричной ДНК для гибридизации зондов наряду с тестируемой пробой служат также дотированные последовательности. В дальнейшем проводят электрофоретический анализ меченых од-нонитевых фрагментов ДНК. Система успешно апробирована на мута­циях глобиновых генов при серповидно-клеточной анемии и на мутации delF508 при муковисцидозе.

Амплификация рефрактерной мутационной системы

Концептуально близким к этому варианту является метод, получивший название «амплификация рефрактерной мутационной системы» - amplification refractory mutation system - ARMS. В основе метода лежит неспособность Taql термофильной полнмеразы к амплификации фрагмента при наличии несоответствия (mismatch) между матричной ДНК и З'-концом одного из олигопраймеров [Newton C.R. et al., 1989; Bottema C.D.K. et al., 1990].   
Стрелкой показаны неспаренные нуклеотиды, а звездочки обозначают место мутации, подчеркнут сейт реструкции Mspl.
Суть метода заключается в одновременном проведении двух ПЦР, для каждой из которых одним из праймеров служит аллель-специфическая мутантная или нормальная олигонуклеотидная последовательность соответственно. При этом в качестве второго праймера для проведения двух реакций выбирают одну и ту же олигонуклеотидную после­довательность, так что в обоих случаях могут амплифицироваться участки ДНК одинаковой протяженности. Мутантный сайт в аллель-специфических праймерах расположен не в центре, а ближе к З'-концу, и чаще всего занимает предпоследнюю позицию. При определенных усло­виях, важнейшим из которых является концентрация ионов магния в растворе, наличие сайта негомологичного спаривания в З'-области праймера препятствует началу синтеза ДНК. Таким образом, при нали­чии мутации в исследуемой матричной ДНК амплифицированные фраг­менты образуются только в том случае, если в качестве аллель-специфического праймера выбирается мутантная последовательность, тогда как при использовании нормального олигонуклеотидного праймера ПЦР блокируется. Метод нашел широкое применение для детекции мутаций при фе-нилкетонурии, бета-талассемии, муковисцидозе, при типировании генов HLA-системы. Однако сложности в подборе праймеров и в выборе оп­тимального режима ПЦР ограничивают широкое применение этого ме­тода. Вместе с тем его несомненным преимуществом является возмож­ность применения полностью автоматического сканирования.

МОЛЕКУЛЯРНОЕ СКАНИРОВАНИЕ ИЗВЕСТНЫХ МУТАЦИЙ

Рассмотренные выше методы обнаружения мутаций предполагают обязательное секвенирование содержащих их сегментов ДНК с целью точной идентификации нуклеотидных нарушений, оценки их фенотипи-ческого проявления и определения причастности к развитию болезни. Поэтому они редко используются в практической диагностике н при популяционном скрининге гетерозигот. После описания мутации появляется возможность ее анализа более простыми способами, не требующими секвеннрования. Как упоминалось выше, мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов, могут быть выявлены с помощью нативного электрофореза в полиакриламидном или агарозном 'гелях.
Из миссенс-мутаций наиболее просто диагностируются те замены нуклеотидов, которые приводят к исчезновению или образованию сайта узнавания для какой-нибудь из рестрнктаз. Они выявляются по изменению длины амплифицированного фрагмента ДНК после его обработки соответствующей эндонуклеазой. Поэтому сразу после идентификации мутации проводится компьютерный поиск возможных сайтов рестрикции в месте локализации замены основания. Вероятность такого события довольно велика, так как для каждой из нескольких сотен известных в настоящее время рестрнкционных эндонуклеаз сайтом узнавания служит своя специфическая последовательность ДНК, средние размеры которой составляют 5-6 нуклеотидов.
Если естественных рестрнкционных сайтов в месте мутации найти не удается, то такие сайты могут быть созданы искусственно. В частности, разработана методика создания с помощью ПЦР новых сайтов рестрикции в мутантных аллелях, но не в аллелях дикого типа -метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза [Eiken H.G. et al., 1991; Ngo I.C.L. et al., 1991 ]. Для этого амплнфнцнруе-мый участок ДНК выбирают таким образом, чтобы З'-конец одного из праймеров непосредственно примыкал к мутантному сайту (рис. 4.8). Именно этот праймер неполностью комплементарен матричной ДНК. В нем изменяют одни нз нуклеотидов с З'-конца так, чтобы в сочетании с нуклеотндом мутантного, но не нормального сайта в этом месте образовывался сайт рестрикции для какой-нибудь из эндонуклеаз. Тогда после рестрикции и электрофореза продуктов амплификации геномной ДНК у индивидуумов, не содержащих данную мутацию, на электрофореграмме будет присутствовать один нерест-рицированный фрагмент, у гетерозигот появится два дополнитель­ных фрагмента, соответствующих по длине рестрнцированным сегментам ДНК, н у гомозигот по мутации будут присутствовать только эти два фрагмента.

Исследование ДНК

При проведении исследования эталонную меченую (*) ДНК смеши­вают с избытком тестируемой ДНК (или РНК). Тестируемыми образцами ДНК могут служить клонированные ДНК, обработанные соответст­вующими эндонуклеазами, либо амллифицированные фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых молекул и затем охлаж­дают, чтобы создать условия для образования дуплексов. При наличии мутаций в тестируемых образцах ДНК в гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК, образуются места негомологичного спаривания. По­сле обработки соответствующими химическими агентами идентификация и локализация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК проводится путем электрофореза и радиоавтографии. Появление укороченных фрагментов ДНК на электрофореграмме (а точнее - необычных бэндов в нижней части геля) свидетельствует о наличии мутантного сайта, а определение размера укороченных фрагментов однозначно определяет локализацию этого сайта в исходной тестируемой молекуле ДНК. Современные модификации метода CMC позволяют идентифицировать    
до 95-100% мутаций [Grompe M., 1993]. Большими преимуществами этого метода являются:
*  возможность исследовать протяженные участки ДНК - до 2 тыс. п.о.;
*  способность одновременно выявить и локализовать несколько му­таций в одном фрагменте ДНК;
*  возможность одновременно использовать несколько ДНК-зондов для поиска мутаций - мультиплексный вариант методики.
К числу недостатков можно отнести высокую токсичность исполь­зуемых химических реактивов. Последняя может быть частично ослаб­лена использованием карбодиимида для идентификации GT-гетеродуп-лексов.
Весьма близким по принципу к CMC-методу является метод расщеп­ления гетеродуплексов РНКазой А. С этой целью создаются условия для образования гетеродуплексов между тестируемой ДНК и комплементар­ной ей радиоактивно меченной РНК-пробой. При обработке РНКазой А происходит разрезание молекул РНК в местах нарушения спаривания оснований. Места точечных мутаций определяются, как и в случае CMC, по размерам образовавшихся фрагменгов после электрофореза и радио­автографии. Необходимость использования радиоактивно меченной РНК-пробы и возможность детекции только около 50% точечных мутаций лимитируют широкое применение метода [Grompe M., 1993].
Первичная идентификация мутаций может быть осуществлена 1гутем анализа нарушений не в нуклеотидной последовательности гена, а в аминокислотной последовательности соответствующего полипептндно-го продукта. Для этого выделяют тотальную мРНК из лейкоцитов крови, проводят обратную транскрипцию, амплифнцируют специфические эк-зоны кДНК (метод RT-PCR), встраивают амплифицированную область ДНК в экспресснонную систему и анализируют образовавшийся продукт. Этот метод особенно эффективен при детекции мутаций в протяженных генах, содержащих большое число экзонов, таких как ген мио-патии Дюшенна или ген нейрофиброматоза 1.

Гетеродуплексный анализ

НА (Heteroduplex analysis) - гетеродуплексный анализ позволяет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде или в гетерози­готном состоянии. Следует заметить, что у подавляющего большинства пациентов с генными болезнями, наследуемыми по аутосомно-рецес-сивному типу, мутации в гомологичных хромосомах находятся в компа­унде, т. е. в каждом из гомологичных генов имеются функционально значимые нарушения, но их молекулярная природа и внутригенная ло­кализация различны. Исключение составляют лишь мажорные мутации, частота которых в популяции достигает десятков процентов. Примерами таких мутаций являются AF508 в гене муковисцидоза или мутация R408W в гене фенилкетонурии. Принцип НА-метода заключается в том, что при амплификации относительно небольших фрагментов генов гете-розигот или гомозиготных компаундов мутация может быть локализована лишь в одной из гомологичных нитей матричной ДНК. Поэтому в амплификационной смеси наряду с двумя типами гомодуплексов обра­зуются гетеродуплексы между нормальной и мутантной цепочками ДНК. Такие гетеродуплексные молекулы ДНК имеют иную электрофо-ретическую подвижность по сравнению с гомодуплексами (не отли­чающимися между собой по подвижности) за счет конформационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов (mismatch). Эти различия могут быть обнаружены при электрофорезе в обычном полиакриламидном геле.

Разделение фрагментов ДНК

В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Таким способом удается идентифицировать лишь около 50% однонуклеотидных замен в фрагментах ДНК длиной от 50 до нескольких сотен нуклеотидов. Связано это с тем, что при прохождении ДНК через гель может начаться частичная денатурация концов молекул еще до достижения оптимальной области плавления. Поэтому мутации, локализованные вблизи концов амплифициро-ванных участков ДНК, оказывают меньшее влияние На процесс плавления и могут не выявляться. Эффективность обнаружешия мутаций с помощью фадиентного денатурирующего электрофореза может быть существенно повышена за счет присоединения к концам амплифициро-ванной геномной ДНК синтетических фрагментов GC-нуклеотидов длиной в несколько десятков пар оснований. Такие монотонные тугоплавкие концы выполняют роль своеобразных зажимов и резко увеличивают шансы обнаружения всех точечных мутаций, независимо от их локали­зации внутри исследуемого фрагмента ДНК. Эта модификация делает метод очень чувствительным. В отличие от SSCP, он при­годен для более крупных амплифицированных фрагментов ДНК. При исследовании фрагментов до 600 п.о. эффективность выявления мутаций этим методом достигает 95%. Чаще всего DGGE-метод применяется для скрининга мутаций в амплифицированных экзонах, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК.
Этот метод может быть с успехом применен также для анализа инду­цированных мутаций, так как позволяет улавливать точечные мутации, возникшие даже в одной из 100 обработанных мутагеном клеток. К не­достаткам метода следует отнести техническую сложность получения равномерного градиента денатурирующего агента в полиакриламид-ном геле, а также высокую стоимость искусственно синтезированных GC-концов.

Идентификации бэндов на электрофореграмме

Иногда амплификацию проводят без использования метки, но тогда для лучшего разделения ДНК и однозначной идентификации бэндов на электрофореграмме используют специальные гели - Hydrolink либо MDE (AT Biochem, USA), а также более чувствительные по сравнению с бромидом этидия методы окрашивания, такие как окраска нитратом серебра. На процесс конформации оказывают влияние различные внешние факторы: температура, концентрация акриламида и глицерина в геле, ионная сила буферных растворов [Glavac D., Dean M, 1993]. Оптимальный подбор этих параметров позволяет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК, различающиеся даже всего на один нуклеотид. Конформационный метод выявления точечных мутаций быстро получил широкое распространение благодаря своей простоте и возможности обнаруживать любые типы замен. Эффективность детекции мутаций при размерах амплифицируемого фрагмента менее 200 п.о. составляет 70-95%, но при длине фрагмента, превышающей 400 п.о., вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.
DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - метод денатури­рующего градиентного гель-электрофореза - основан на зависимости свойств плавления (или денатурации) небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А-Т- и G-C-nap в исследуемых фрагментах [Майерс Р. и др., 1990; Fodde R., Losekoot M., 1994]. Объясняется это тем, что G-C-связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т. Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях (рис. 4.5). Градиент денатурации достигается разницей температур, различной концентрацией мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют по-разному. Разрабо­тан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плав­ления в зависимости от нуклеотидной последовательности [Lerman L.S., Silverstein К., 1987]. При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом кон­центраций денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквива­лентной температуре плавления - t,,,, т. е. такой температуре, при которой каждая пара оснований с 50 % вероятностью может соединиться или разойтись. После начала плавления продвижение двухнитевого фраг­мента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространст­венной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК.

Преимущества и недостатки различных методов детекции мутаций

При мутациях гена, представляющих собой замену одного или не­скольких нуклеотидов, длины амплифицированных фрагментов остаются постоянными, однако, некоторые физико-химические свойства му-тантных молекул ДНК меняются. Так, например, при гибридизации од-нонитевых ДНК, комплементарных нормальной и мутантной нитям ДНК, возникают структурные нарушения в месте негомологичного спа­ривания. С учетом этих особенностей разработаны различные варианты поиска мутантных фрагментов ДНК и идентификации в них точечных мутаций. Ведущими из этих методов являются: метод анализа конфор-мационного полиморфизма однонитевой ДНК - SSCP, денатурирующий градиентный гель-электрофорез - DGGE, метод химического расщепления некомплементарных сайтов (CMC), метод гетеродуплексного анализа (НА) и, наконец, собственно метод секвенирования.

Преимущества и недостатки различных методов детекции мутаций   
    Название    Размер исследу­емого участка, тыс п.о.    Чувствитель­ность    Локали­зация    Токсичность    Сканирова­ние экзонов    Сканирова­ние мРНК   
    SSCP    250    80%    Нет    Нет    +++    +   
    DGGE    600    95%    Нет    Формамид    ++    -н-   
    CMC    1700    >95%    Да    Да    +    +++   
    PCRDS    500    >99%    Да    Нет    ++    ++   
    НА    300    80%    Нет    Нет    ++    +   
    Примечание. Чувствительность - приблизительный процент мутаций, обнаруживаемых данным методом; локализация - да - означает, что метод дает возможность точной локализации мутации внутри исследуемого фрагмента; +++ - высокая, ++ - средняя, + -ограниченная возможность использования данного метода для указанных целей.   
    SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, предложенный М. Орита с соавт. [Orita M. et al., 1989; Glavac D., Dean M., 1993], основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности од-нонитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотидных замен по пространственной организации молекул. Скручивание, или конформация, небольших однонитевых ДНК существенно зависит от их нуклеотиднои последовательности, так что замена даже одного основания в молекулах одинакового размера приводит к изменению их пространственной структуры. Метод включает амплификацию специфических сегментов ДНК размером от 50 до 300 пар оснований, обычно в присутствии меченых dNTP, денатурацию образовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий электрофорез в полиакриламидном геле.

Анализ делеции в аутосомных генах

Метод этот, однако, не обнаруживает подобные делеции, находящиеся в гетерозиготном состоянии или локализованные в аутосомных генах, так как нормальная гомологичная последовательность геномной ДНК может служить матрицей для амплификации любых фрагментов. Данный подход применим к анализу делеции в аутосомных генах только в тех случаях, когда возможно дополнить ПЦР количественной оценкой результатов амплификации, провести так называемую количественную ПЦР. Оригинальный метод идентификации подобных делеции у гетерозигот основан на использовании в качестве матричной ДНК для ПЦР кДНК, полученной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей или культур клеток пациента. В отличие от нормального гомолога, в мутантной молекуле кДНК граничащие с делецией экзоны сближены. Если в качестве олигопраймеров для ПЦР будут выбраны последо­вательности из этих областей гена, только мутантная кДНК будет служить матрицей для амплификации небольшого участка между прайме-рами из фланкирующих делецию экзонов. В нормальной последовательности кДНК этот участок может быть слишком велик для того, чтобы прошла амплификация. Практически для обнаружения гетерозигот по протяженным внутригенным делециям проводят мультиплексную ПЦР с использованием системы олигопраймеров, обеспечивающих амплифи­кацию фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Наличие делеции регистрируют по появлению продуктов амплификации необычного размера.
Небольшие делеции и вставки нуклеотидов не приводят к отсутствию амплифицированных фрагментов ДНК, но изменяют их размеры. Эти изменения могут быть зарегистрированы при электрофорезе продуктов амплификации в полиакриламидном или агарозном гелях . Именно этот метод используется для детекции наиболее часто встречающейся мутации в гене муковисцидоза - делеции трех нуклеотидов - AF508. После выявления различий между нормальной и мутантной ДНК по длине рестрикционных или амплифи-цированых фрагментов гена необходимо провести секвенирование необычного фрагмента с целью определения изменений в первичной структуре мутантной ДНК-последовательности по сравнению с нормальной.

секвенирование полноразмерной кДНК

Однако в общем случае секвенирование полноразмерной кДНК, или всех экзонов, для генотипирования мутаций у отдельных пациентов дос­таточно трудоемко, дорого и требует больших затрат времени. Поэтому на практике чаще проводят предварительный отбор более простыми методами амплифицированных, а иногда клонированных фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации, а затем секвенируют только эти участки ДНК. Методы поиска фрагментов ДНК, предполо­жительно содержащих мутации, основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных последовательностей по целому ряду физиче­ских и химических характеристик, которые в значительной степени варьируют в зависимости от типа мутационного повреждения. Следует подчеркнуть, что, независимо от метода детекции мутации и практически независимо от ее природы (замены нуклеотидов, делеции, дупликации и пр.), точные молекулярные характеристики каждой мутации могут быть получены только путем прямого секвенирования. При наличии в амплифицированном фрагменте известных сайтов рестрикции положе­ние мутации может быть предварительно уточнено. Для этого продукты амплификации разрезают соответствующей эндонуклеазой и исследуют более короткие фрагменты.
Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие длину ам­плифицированных фрагментов, так как подобные нарушения легко вы­являются при электрофоретическом анализе. Так, протяженные делеции, захватывающие целые экзоны, могут быть выявлены по изменению дли­ны рестрикционных фрагментов, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Более простая и эффективная методика выявления таких мутаций в генах, сцепленных с полом, основана на одновременной ам­плификации различных экзонов, наиболее часто вовлекаемых в подобные перестройки, так называемый мультиплексный вариант ПЦР. Разница в размерах и числе амплифицированных фрагментов позволяет легко идентифицировать такие мутации на электрофорезе. Особенно широко этот метод используется для идентификации делеции в гене дистрофина, на долю которых приходится около 60% всех мутаций, приводящих к миодистрофии Дюшенна. При отсутствии делеции все амплифицированные фрагменты после электрофоретиче-ского разделения и окрашивания можно наблюдать в виде отдельных полос. Если в исследуемой ДНК какие-то из экзонов делегированы, будут отсутствовать и соответствующие им полосы на электрофореграмме. Выбирая специфические участки гена для амплификации, можно оценить размер делеции с точностью до отдельных экзонов, а также определить ее внутригенную локализацию.

ПЕРВИЧНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ

Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого сек-венирования мутантной кДНК или отдельных экзонов, и часто первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осуществляют именно таким образом. Сам метод секвенирования уже был рассмотрен ранее. Для некоторых генов, имеющих небольшие размеры, метод прямого секвенирования с успехом применяется как основной метод сканирования мутаций. Так, в частности, особенно удобным оказалось его применение для детекции мутаций в сравнительно небольших по размеру генах, таких, например, как ген фактора IX свертывания крови (гемофилия В). Использование эктопической мРНК для получения амплифицированных фрагментов кДНК открывает особенно широкие возможности для применения метода прямого секвенирования.
Разработанные в последние годы модификации методов ПЦР значи­тельно облегчили секвенирование амплифицированных фрагментов и повысили его эффективность. Так, в частности, предложен вариант асимметричной ПЦР, когда при амплификации концентрация одного из олигопраймеров в несколько десятков раз превосходит концентрацию другого праймера, в результате чего синтезируется преимущественно только одна, нужная для секвенирования цепочка ДНК. Для этой же цели (получения одноцепочечной ДНК) предложено использование маг­нитных частиц с фиксированным на их поверхности стрептавидином. При этом один из праймеров для проведения ПЦР метится биотином. Затем к продуктам амплификации добавляют магнитные частицы с пришитым стрептавидином. Благодаря прочному связыванию биотин -стрептавидин, меченная биотином последовательность ДНК фиксируется на магнитных частицах. С помощью щелочного лизиса с частиц удаляют вторую немеченую комплементарную последовательность ДНК, которую и используют для секвенирования. Еще в одном варианте амплификацию проводят в присутствии праймеров, несущих сайт узнавания для фермента Т7 - РНК-полимеразы. После амплификации в системе in vitro проводят транскрипцию амплификата с помощью Т7 - РНК-полимеразы, и образовавшуюся одноцепочечную РНК используют для секвенирования - метод GAWTS (genome amplification with transcript sequences).

Получение геномной мутантной ДНК

Получение геномной мутантной ДНК обычно не представляет сложностей, так как она может быть изолирована из любых клеток или тканей больного независимо от характера экспрессии исследуемого гена. Однако амплификация целых экзонов возможна только при знании нуклеотидных последовательностей фланкирующих интронных областей, из которых и производят подбор специфических олигопрай-меров. Секвенирование интронов представляет собой достаточно трудоемкую задачу, решенную далеко не для всех клонированных генов. Таким образом, к ограничениям этого подхода'следует отнести необходимость достаточно полной информации о структуре гена и о его первичной нуклеотидной последовательности. Кроме того, объектом тестирования могут быть лишь сравнительно небольшие области гена, отсюда для получения более полной информации необходима амплификация многих экзонов. Стратегия идентификации мутаций может быть различной и, в ко­нечном счете, определяется тем, имеем ли мы дело с ранее неизвест­ными мутациями, либо целью анализа является скринирование уже известных мутаций. В первом случае объектом исследования чаще всего служат клонированные или амплифицированные последовательности кДНК, тогда как при молекулярной диагностике известных мутаций, как правило, анализируют амплифицированные фрагменты геномной ДНК.

Для анализа мутантных аллелей

Для анализа мутантных аллелей прежде всего необходимо иметь изолированные последовательности мутантного гена, которые могут быть получены либо путем клонирования или амплификации мутантной кДНК, либо за счет специфической амплификации отдельных экзонов, их частей и регуляторных областей гена с использованием в качестве матрицы геномной ДНК пациентов. В первом случае отбирают клони­рованные кДНК-последовательности мутантного гена, проводя скрининг библиотек кДНК, сконструированных из специфических тканей
или культур клеток больного. При этом в качестве зондов используют последовательности кДНК нормального гена. Другим источником коди­рующих последовательностей мутантного гена может служить мРНК, изолированная из экспрессирующих тканей или клеток больного. Му-тантную кДНК получают путем специфической амплификации пере­крывающихся последовательностей кодирующих областей гена, используя в качестве матрицы тотальную кДНК, полученную при обратной транскрипции изолированной мРНК. Преимуществом этого подхода является то, что праймеры для амплификации выбирают из экзонных областей, нуклеотидные последовательности которых, как правило, ста­новятся известны вскоре после идентификации и клонирования гена. В ряде случаев изоляция мутантной мРНК затруднена в связи с недоступ­ностью образцов тканей или органов, в которых происходит экспрессия нужного гена (мозг, печень и др.). Однако обнаружение следовых коли­честв так называемой незаконной, или эктопической, мРНК во многих клетках и тканях, в том числе в клетках крови, позволяет преодолевать и эти трудности [Kaplan J.-C. et al., 1992]. Успех подобной процедуры получения мутантной кДНК связан, в первую очередь, с разработкой эффективных методов выделения и обратной транскрипции мРНК с сохранением всех типов кДНК, включая те, для которых соответствующие мРНК присутствуют в ничтожных концентрациях (например, мРНК дис-трофина при мышечной дистрофии Дюшенна (см. главу 10)). Единственным принципиальным ограничением методов детекции мутаций в последовательностях кДНК является невозможность выявления мутаций в регуляторных и интронных частях гена. Подобные мутации могут быть выявлены только при анализе геномной ДНК пациента.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ СТРУКТУРНЫХ МУТАЦИЙ. ИЗОЛЯЦИЯ МУТАНТНЫХ ДНК

Идентификация мутантных аллелей, т. е. обнаружение нарушений в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, является самым точ­ным методом молекулярной диагностики наследственных заболеваний. Большие перестройки - делении, дупликации, инверсии, транслокации -размером более 1 млн п.о., затрагивающие целые гены или даже несколько генов, могут быть обнаружены на цитологических препаратах с исполь­зованием карт высокого разрешения (анализ дифференциально окрашен­ных прометафазных хромосом). Еще большая разрешающая способность (до 50 тыс. п.о.) может быть достигнута при работе на специальным обра­зом приготовленных (растянутых) интерфазных хромосомах с использо­ванием техники гибридизации in situ (FISH)
Мутации, изменяющие длину рестрикционных фрагментов, могут быть выявлены путем блот-гибридизации рестрицированной геномной ДНК с соответствующими ДНК-зондами на стадиях генетического ана­лиза, предшествующих молекулярному клонированию гена. К числу таких мутаций относятся достаточно протяженные, но не идентифици­руемые цитогенетически, внутригенные делеции, инсерции и дуплика­ции, а также точечные мутации, локализованные в сайтах рестрикции. Непременным условием реализации метода блот-гибридизации для по­иска подобных мутаций является наличие ДНК-зонда, являющегося либо частью гена, либо тесно сцепленной с этим геном клонированной ДНК-последовательностью. При поиске таких мутаций геномную ДНК от здорового донора и больного обрабатывают часто щепящими рест-риктазами, подвергают электрофорезу, блот-гибридизации с меченым ДНК-зондом по стандартной схеме (см. главу 1) и проводят сравнитель­ный анализ расположения бэндов на радиоавтографе. Особенно инфор­мативными обычно оказываются рестриктазы Mspl и Taql, которые узнают сайты CCGG и TCGA, соответственно. Благодаря наличию CpG-последовательностей, эти сайты особенно часто подвергаются спонтан­ному мутированию (см. 4.5). Наличие протяженных делеций либо то­чечных мутаций в сайтах рестрикции приводит к изменениям размеров рестрикционных фрагментов. Целенаправленный поиск других точечных мутаций (не затрагивающих сайты рестрикции) и небольших структурных аномалий возможен только для клонированных генов с известной нуклеотидной последовательностью смысловых участков ДНК. Методы идентификации подобных мутаций основаны главным образом на использовании полимеразной цепной реакции в ее различных модифи­кациях

Отсчет нуклеотидов в молекуле ДНК

Отсчет нуклеотидов в молекуле ДНК начинается с первого смы­слового кодона, так что нуклеотид под номером +1 соответствует первому нуклеотиду в молекуле кДНК. Вверх по течению (или справа налево от 3' к 5'-концу) от первого кодона нуклеотиды записывают со знаком «-», вниз по течению (от 5' - к 3') - со знаком «+». Для многих генов отсутствие точных данных о положении инициирующего сайта и наличие нескольких мест инициации транскрипции существенно затрудняют нумерацию нуклеотидов. Нуклеотиды экзонов обозначают заглавными буквами, нитронов - прописными. В табл. 4.2. даны примеры обозначения различных мутаций с использованием как аминокислотной, так и нуклеотидной нумерации. Нуклеотидная система записи особенно важна для обозначения делеций, инсерции, сплайсинговых мутаций и полиморфизмов, не связанных с заменами аминокислот или происходящих в нетранслируемых частях гена. В случае делеции или инсерции одного или двух нуклеотидов приводится их буквенное обозначение. Например, 441delA, 485insTA. При делеции или инсерции трех и более нуклеотидов указывается только их число. Так, 852del22 означает делецию 22 нуклеотидов, начиная с 852-го нуклеотида, a 3320ins7 обозначает вставку 7 пар оснований после нуклео-тида 3320. В случае больших вставок или делеций их размеры указываются в килобазах, например 2115insl3kb, или обозначаются соответствующие инсертированные/делетированные структурные элементы генома. Так, 2115insAlu означает инсерцию Alu-повтора после нуклеотида 2115.

Примеры обозначения мутации в гене муковисцидоза   
    Название    Изменения в нуклеотидах    Позиция    Изменения в аминокислотах    Позиция    Экзон   
    Миссенс                       
    D44G    A-G    263    Asp-Gly    44    2   
    А455Е    С-А    1496    Ala-Glu    455    9   
    S549R(A-C)    А-С    1777    Ser - Arg    549    11   
    S549R(T-G)    T-G    1779    Ser - Arg    549    11   
    Нонсенс                       
    Q39X    С-Т    247    Gin - Stop    39    2   
    W1282X    G-A    3978    Trp - Stop    1282    20   
    Вставка, деле-                       
    ния, сдвиг рам-                       
    ки считывания                       
    del F508    Делеция 3 п.о.    1652-1655    Делеция F    508    10   
    241delAT    Делеция AT    241    Сдвиг рамки        2   
    852del22    Делеция 22 п.о.    852    Сдвиг рамки        6а   
    1154insTC    Вставка ТС    1154    Сдвиг рамки        7   
    Сплайсинг                       
    621+1G-T    G-T    621+1    5'-сигнал        Интрон4   
    622-2A-C    А-С    622-2    3'-сигнал        Интрон 4   
    3849+10kbC-T    С-Т    10 kb экзон 19    Ошибочный сплайсинг        Интрои 19   
    Полиморфизмы                       
    M/V470    А нлиО    1540    М wmG    470    10   
    1716G/A    G или А    1716    Без изменений    528    10   
    I25G/C    ОилиС    125    5'-нетранслируе-мая область    —    —   
    При обозначении сплайсинговых мутаций записывают номер край­него нуклеотида в ближайшем к мутации экзоне, число нуклеотидов (со знаком «+» в случае З'-конца экзона и со знаком «-» в случае 5'-конца) и характер нуклеотидной замены. Например, запись 711+5G-T обозначает замену G на Т в 5-м основании нитрона, следующего за экзоном, заканчивающимся 711-м нуклеотидом.