Предварительно геномная ДНК

Предварительно геномная ДНК переваривается редкощепящей рестриктазой, в результате чего образуются большие фрагменты ДНК, соот­ветствующие по длине одному прыжку. Затем эти фрагменты перево­дятся в кольцевую форму за счет искусственного присоединения к их концам небольшого маркерного гена. При этом концы рестрикционных фрагментов сближаются. Кольцевые молекулы ДНК разрезают средне-щепящими рестриктазами и из пула относительно небольших фрагментов ДНК отбирают те, которые содержат маркерный ген, а следовательно, и окружающие его концевые участки исходных крупных фрагментов. Отобранные последовательности клонируют в фаговых или кос-мидных векторах, получая библиотеку генов концевых участков. Затем в этой библиотеке проводят скрининг клонов, содержащих стартовый зонд. Только в этих клонах комплементарные зонду последовательности соединены маркерным геном с последовательностями ДНК, отстоящими от стартового участка поиска на длину прыжка. При необходимости промежуточные сегменты ДНК также могут быть клонированы с использованием метода скользящего зондирования.
Остановимся теперь на тех критериях, по которым можно отличить сегменты ДНК, являющиеся частями генов, от любых других последова­тельностей (рис. 3.5.) [Lindsay S., Bird A., 1987; Rommens J.M. et al., 1989; Wicking C, Williamson R., 1991; Collins F.S., 1992]. Условно эти критерии могут быть разделены на три группы. В первой группе исследуют структурные особенности генных последовательностей. Вторая группа критериев основана на поиске функциональных участков генов. В третьем случае анализируют характер нуклеотидных последовательностей тестируемых фрагментов ДНК. Диагностику структурных участков генов осуществляют путем гибридизации с ДНК-зондами или прямым скринированием библиотек кДНК. Функциональная диагностика генов включает улавливание экзонов (exon trapping), промоторных участков, поли-А-сигнальных последовательностей, а также перенос генов в иные конструкции и идентификацию в них соответствующих транскрип-тов. И, наконец, поиск генов может быть осуществлен путем прямого секвенирования крупных фрагментов ДНК с последующим компьютер­ным анализом нуклеотидной последовательности и сопоставлением ее с присутствующими в базах данных идентифицированными генами других видов живых существ.