Идентификация мутантных аллелей, т. е. обнаружение нарушений в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, является самым точным методом молекулярной диагностики наследственных заболеваний. Большие перестройки - делении, дупликации, инверсии, транслокации -размером более 1 млн п.о., затрагивающие целые гены или даже несколько генов, могут быть обнаружены на цитологических препаратах с использованием карт высокого разрешения (анализ дифференциально окрашенных прометафазных хромосом). Еще большая разрешающая способность (до 50 тыс. п.о.) может быть достигнута при работе на специальным образом приготовленных (растянутых) интерфазных хромосомах с использованием техники гибридизации in situ (FISH)
Мутации, изменяющие длину рестрикционных фрагментов, могут быть выявлены путем блот-гибридизации рестрицированной геномной ДНК с соответствующими ДНК-зондами на стадиях генетического анализа, предшествующих молекулярному клонированию гена. К числу таких мутаций относятся достаточно протяженные, но не идентифицируемые цитогенетически, внутригенные делеции, инсерции и дупликации, а также точечные мутации, локализованные в сайтах рестрикции. Непременным условием реализации метода блот-гибридизации для поиска подобных мутаций является наличие ДНК-зонда, являющегося либо частью гена, либо тесно сцепленной с этим геном клонированной ДНК-последовательностью. При поиске таких мутаций геномную ДНК от здорового донора и больного обрабатывают часто щепящими рест-риктазами, подвергают электрофорезу, блот-гибридизации с меченым ДНК-зондом по стандартной схеме (см. главу 1) и проводят сравнительный анализ расположения бэндов на радиоавтографе. Особенно информативными обычно оказываются рестриктазы Mspl и Taql, которые узнают сайты CCGG и TCGA, соответственно. Благодаря наличию CpG-последовательностей, эти сайты особенно часто подвергаются спонтанному мутированию (см. 4.5). Наличие протяженных делеций либо точечных мутаций в сайтах рестрикции приводит к изменениям размеров рестрикционных фрагментов. Целенаправленный поиск других точечных мутаций (не затрагивающих сайты рестрикции) и небольших структурных аномалий возможен только для клонированных генов с известной нуклеотидной последовательностью смысловых участков ДНК. Методы идентификации подобных мутаций основаны главным образом на использовании полимеразной цепной реакции в ее различных модификациях
суббота
ИДЕНТИФИКАЦИЯ СТРУКТУРНЫХ МУТАЦИЙ. ИЗОЛЯЦИЯ МУТАНТНЫХ ДНК
