Другим важным шагом на пути клонирования и анализа больших субхромосомных фрагментов ДНК явилась разработка методов их разделения путем гель-электрофореза в пульсирующем поле [Smith C.L., Cantor C.R., 1986; Barlow D.P., Lehrach H., 1987; Smith C.L. et al., 1987]. В соответствии со стандартными методами электрофореза под действием однонаправленного постоянного поля в агарозном или в полиакри-ламидном гелях удается разделять фрагменты ДНК размером не более 30 - 50 тыс. п.о. Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем изменении направления электрического поля происходит, по-видимому, за счет конформационных изменений, обусловленных скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переключения направления поля. При этом более короткие молекулы легче адаптируются к изменению условий и потому движутся в геле быстрее. Существуют различные варианты пульсирующего гель-электрофореза, главным образом связанные с геометрическим расположением направлений полей - ортогональный, гексагональный, инверсионный. При использовании любого из этих вариантов могут быть разделены молекулы ДНК размером от 50 тыс. п.о. до более чем 9 млн п.о. Эффективность разделения фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от условий проведения электрофореза (напряжения, температуры буфера, концентрации агарозы, времени одного импульса). В качестве маркеров для определения величины больших молекул ДНК используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих специфические последовательности, также может быть осуществлен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами
