Исследование ДНК

При проведении исследования эталонную меченую (*) ДНК смеши­вают с избытком тестируемой ДНК (или РНК). Тестируемыми образцами ДНК могут служить клонированные ДНК, обработанные соответст­вующими эндонуклеазами, либо амллифицированные фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых молекул и затем охлаж­дают, чтобы создать условия для образования дуплексов. При наличии мутаций в тестируемых образцах ДНК в гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК, образуются места негомологичного спаривания. По­сле обработки соответствующими химическими агентами идентификация и локализация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК проводится путем электрофореза и радиоавтографии. Появление укороченных фрагментов ДНК на электрофореграмме (а точнее - необычных бэндов в нижней части геля) свидетельствует о наличии мутантного сайта, а определение размера укороченных фрагментов однозначно определяет локализацию этого сайта в исходной тестируемой молекуле ДНК. Современные модификации метода CMC позволяют идентифицировать    
до 95-100% мутаций [Grompe M., 1993]. Большими преимуществами этого метода являются:
*  возможность исследовать протяженные участки ДНК - до 2 тыс. п.о.;
*  способность одновременно выявить и локализовать несколько му­таций в одном фрагменте ДНК;
*  возможность одновременно использовать несколько ДНК-зондов для поиска мутаций - мультиплексный вариант методики.
К числу недостатков можно отнести высокую токсичность исполь­зуемых химических реактивов. Последняя может быть частично ослаб­лена использованием карбодиимида для идентификации GT-гетеродуп-лексов.
Весьма близким по принципу к CMC-методу является метод расщеп­ления гетеродуплексов РНКазой А. С этой целью создаются условия для образования гетеродуплексов между тестируемой ДНК и комплементар­ной ей радиоактивно меченной РНК-пробой. При обработке РНКазой А происходит разрезание молекул РНК в местах нарушения спаривания оснований. Места точечных мутаций определяются, как и в случае CMC, по размерам образовавшихся фрагменгов после электрофореза и радио­автографии. Необходимость использования радиоактивно меченной РНК-пробы и возможность детекции только около 50% точечных мутаций лимитируют широкое применение метода [Grompe M., 1993].
Первичная идентификация мутаций может быть осуществлена 1гутем анализа нарушений не в нуклеотидной последовательности гена, а в аминокислотной последовательности соответствующего полипептндно-го продукта. Для этого выделяют тотальную мРНК из лейкоцитов крови, проводят обратную транскрипцию, амплифнцируют специфические эк-зоны кДНК (метод RT-PCR), встраивают амплифицированную область ДНК в экспресснонную систему и анализируют образовавшийся продукт. Этот метод особенно эффективен при детекции мутаций в протяженных генах, содержащих большое число экзонов, таких как ген мио-патии Дюшенна или ген нейрофиброматоза 1.