ПЕРВИЧНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ

Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого сек-венирования мутантной кДНК или отдельных экзонов, и часто первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осуществляют именно таким образом. Сам метод секвенирования уже был рассмотрен ранее. Для некоторых генов, имеющих небольшие размеры, метод прямого секвенирования с успехом применяется как основной метод сканирования мутаций. Так, в частности, особенно удобным оказалось его применение для детекции мутаций в сравнительно небольших по размеру генах, таких, например, как ген фактора IX свертывания крови (гемофилия В). Использование эктопической мРНК для получения амплифицированных фрагментов кДНК открывает особенно широкие возможности для применения метода прямого секвенирования.
Разработанные в последние годы модификации методов ПЦР значи­тельно облегчили секвенирование амплифицированных фрагментов и повысили его эффективность. Так, в частности, предложен вариант асимметричной ПЦР, когда при амплификации концентрация одного из олигопраймеров в несколько десятков раз превосходит концентрацию другого праймера, в результате чего синтезируется преимущественно только одна, нужная для секвенирования цепочка ДНК. Для этой же цели (получения одноцепочечной ДНК) предложено использование маг­нитных частиц с фиксированным на их поверхности стрептавидином. При этом один из праймеров для проведения ПЦР метится биотином. Затем к продуктам амплификации добавляют магнитные частицы с пришитым стрептавидином. Благодаря прочному связыванию биотин -стрептавидин, меченная биотином последовательность ДНК фиксируется на магнитных частицах. С помощью щелочного лизиса с частиц удаляют вторую немеченую комплементарную последовательность ДНК, которую и используют для секвенирования. Еще в одном варианте амплификацию проводят в присутствии праймеров, несущих сайт узнавания для фермента Т7 - РНК-полимеразы. После амплификации в системе in vitro проводят транскрипцию амплификата с помощью Т7 - РНК-полимеразы, и образовавшуюся одноцепочечную РНК используют для секвенирования - метод GAWTS (genome amplification with transcript sequences).