Идентификации бэндов на электрофореграмме

Иногда амплификацию проводят без использования метки, но тогда для лучшего разделения ДНК и однозначной идентификации бэндов на электрофореграмме используют специальные гели - Hydrolink либо MDE (AT Biochem, USA), а также более чувствительные по сравнению с бромидом этидия методы окрашивания, такие как окраска нитратом серебра. На процесс конформации оказывают влияние различные внешние факторы: температура, концентрация акриламида и глицерина в геле, ионная сила буферных растворов [Glavac D., Dean M, 1993]. Оптимальный подбор этих параметров позволяет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК, различающиеся даже всего на один нуклеотид. Конформационный метод выявления точечных мутаций быстро получил широкое распространение благодаря своей простоте и возможности обнаруживать любые типы замен. Эффективность детекции мутаций при размерах амплифицируемого фрагмента менее 200 п.о. составляет 70-95%, но при длине фрагмента, превышающей 400 п.о., вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.
DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - метод денатури­рующего градиентного гель-электрофореза - основан на зависимости свойств плавления (или денатурации) небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А-Т- и G-C-nap в исследуемых фрагментах [Майерс Р. и др., 1990; Fodde R., Losekoot M., 1994]. Объясняется это тем, что G-C-связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т. Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях (рис. 4.5). Градиент денатурации достигается разницей температур, различной концентрацией мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют по-разному. Разрабо­тан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плав­ления в зависимости от нуклеотидной последовательности [Lerman L.S., Silverstein К., 1987]. При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом кон­центраций денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквива­лентной температуре плавления - t,,,, т. е. такой температуре, при которой каждая пара оснований с 50 % вероятностью может соединиться или разойтись. После начала плавления продвижение двухнитевого фраг­мента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространст­венной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК.