ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ

ПРОГУЛКА И ПРЫЖКИ ПО ХРОМОСОМЕ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗОЛЯЦИЯ ГЕНОВ   
    Мы уже упоминали, что средние размеры гена составляют около 10-30 тыс. п.о., варьируя в широких пределах (см. главу 2, 2.4). Единицы рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов и субхромосомных фрагментов ДНК измеряются миллионами пар нуклеотидов, так же как и размеры фрагментов ДНК, выделяемых с помощью обработки геномной ДНК редкощепящими эндонуклеазами, пульсирующего электрофореза и клонирования в дрожжевых минихромосомах. Переход от этих крупных фрагментов к последовательностям ДНК, сопоставимым с размерами гена, осуществляют с помощью молекулярного клонирования, т. е. получения набора фаговых или космидных клонов, содержащих относи­тельно небольшие последовательности, насыщающие или полностью перекрывающие крупный сегмент ДНК, предположительно содержащий идентифицируемый ген (рис. 3.4). Затем проводят упорядочение клонов в соответствии с взаимным расположением инсертированных в них фрагментов ДНК, осуществляя одновременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью идентификации регуляторных или кодирующих областей генов. Позднее мы подробнее остановимся на тех критериях, с помощью которых можно различить транскрибируемые и не-транскрибируемые участки генома. Для молекулярного клонирования используют различные подходы [Iannuzzi М.С., Collins F.S., 1990]. Прежде всего это насыщающее клонирование, т. е. изоляция из хромосом-специфических библиотек нескольких сотен клонов с целью картирования различными методами инсертированных в них фрагментов ДНК и идентификации клонов с последовательностями, локализованными в заданном районе. Значительно чаще используется тактика скринирова-ния фаговых, космидных и YAC-библиотек, сконструированных из суб­хромосомных сегментов ДНК, предварительно отобранных на основании сцепления с различными ДНК-маркерами. При этом методы выделения субхромосомных сегментов ДНК могут быть самыми различными. Дальнейший поиск в библиотеках генов клонов, содержащих транс­крибируемые последовательности ДНК, осуществляют достаточно тру­доемкими методами, получившими название «прогулки» и «прыжков» по хромосоме.