Методо детекции замен оснований

Универсальным методом детекции замен оснований является метод аллель-специфических олигонуклеотидов - ASO, который включает ам­плификацию фрагментов ДНК и последующую дот- или слот-гибрндизацию с мечеными аллель-специфическими олигонуклеотидами [Reiss J., 1991]. Для этого синтезируют два типа олигонуклеотидных последовательностей обычно размером 19 п.о., в которых мутантный сайт занимает центральное положение. Каждый из этих олигонуклеотидных зондов комплементарен нормальному или мутантному вариантам ДНК, соответственно. Условия гибридизации подбирают таким образом, чтобы дуплексы образовывались только при полной комплементарное™ гибридных пар. В этих условиях амплифицированные фрагменты ДНК без мутации будут гибрнднзоваться только с нормальным зондом, ДНК гомозигот по мутации - только с мутантным и ДНК гете-розигот - с обоими олигонуклеотидамн (рис. 4.10). Для уменьшения перекрестной аллель-специфической гибридизации в реакционную смесь добавляют 30-кратный избыток конкурентного немеченого олиго-нуклеотндного ДНК-зонда. Разработаны удобные модификации метода ASO с использованием аллель-специфических ДНК-зондов, меченных биотином или пероксидазой хрена [Лебедева И.В. и др., 1994].
Наиболее быстрым, экономичным и удобным методом сканирования точечных мутаций является модифицированный вариант ASO, так назы­ваемая гибридизационная система обратного дот-блота (reverse dot-blot hybridisation system) [Saiki R.K. et al., 1989]. Метод позволяет одновре­менно скринировать сразу много точечных мутаций и доступен автома­тизации [Chebab F.F., 1993]. В этом случае проводят гибридизацию ме­ченых продуктов ПЦР, обычно представляющих собой отдельные экзо-ны, с фиксированными на нейлоновых фильтрах аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами (ASO).