При мутациях гена, представляющих собой замену одного или нескольких нуклеотидов, длины амплифицированных фрагментов остаются постоянными, однако, некоторые физико-химические свойства му-тантных молекул ДНК меняются. Так, например, при гибридизации од-нонитевых ДНК, комплементарных нормальной и мутантной нитям ДНК, возникают структурные нарушения в месте негомологичного спаривания. С учетом этих особенностей разработаны различные варианты поиска мутантных фрагментов ДНК и идентификации в них точечных мутаций. Ведущими из этих методов являются: метод анализа конфор-мационного полиморфизма однонитевой ДНК - SSCP, денатурирующий градиентный гель-электрофорез - DGGE, метод химического расщепления некомплементарных сайтов (CMC), метод гетеродуплексного анализа (НА) и, наконец, собственно метод секвенирования.
Преимущества и недостатки различных методов детекции мутаций
Название Размер исследуемого участка, тыс п.о. Чувствительность Локализация Токсичность Сканирование экзонов Сканирование мРНК
SSCP 250 80% Нет Нет +++ +
DGGE 600 95% Нет Формамид ++ -н-
CMC 1700 >95% Да Да + +++
PCRDS 500 >99% Да Нет ++ ++
НА 300 80% Нет Нет ++ +
Примечание. Чувствительность - приблизительный процент мутаций, обнаруживаемых данным методом; локализация - да - означает, что метод дает возможность точной локализации мутации внутри исследуемого фрагмента; +++ - высокая, ++ - средняя, + -ограниченная возможность использования данного метода для указанных целей.
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, предложенный М. Орита с соавт. [Orita M. et al., 1989; Glavac D., Dean M., 1993], основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности од-нонитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотидных замен по пространственной организации молекул. Скручивание, или конформация, небольших однонитевых ДНК существенно зависит от их нуклеотиднои последовательности, так что замена даже одного основания в молекулах одинакового размера приводит к изменению их пространственной структуры. Метод включает амплификацию специфических сегментов ДНК размером от 50 до 300 пар оснований, обычно в присутствии меченых dNTP, денатурацию образовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий электрофорез в полиакриламидном геле.
