Для анализа мутантных аллелей

Для анализа мутантных аллелей прежде всего необходимо иметь изолированные последовательности мутантного гена, которые могут быть получены либо путем клонирования или амплификации мутантной кДНК, либо за счет специфической амплификации отдельных экзонов, их частей и регуляторных областей гена с использованием в качестве матрицы геномной ДНК пациентов. В первом случае отбирают клони­рованные кДНК-последовательности мутантного гена, проводя скрининг библиотек кДНК, сконструированных из специфических тканей
или культур клеток больного. При этом в качестве зондов используют последовательности кДНК нормального гена. Другим источником коди­рующих последовательностей мутантного гена может служить мРНК, изолированная из экспрессирующих тканей или клеток больного. Му-тантную кДНК получают путем специфической амплификации пере­крывающихся последовательностей кодирующих областей гена, используя в качестве матрицы тотальную кДНК, полученную при обратной транскрипции изолированной мРНК. Преимуществом этого подхода является то, что праймеры для амплификации выбирают из экзонных областей, нуклеотидные последовательности которых, как правило, ста­новятся известны вскоре после идентификации и клонирования гена. В ряде случаев изоляция мутантной мРНК затруднена в связи с недоступ­ностью образцов тканей или органов, в которых происходит экспрессия нужного гена (мозг, печень и др.). Однако обнаружение следовых коли­честв так называемой незаконной, или эктопической, мРНК во многих клетках и тканях, в том числе в клетках крови, позволяет преодолевать и эти трудности [Kaplan J.-C. et al., 1992]. Успех подобной процедуры получения мутантной кДНК связан, в первую очередь, с разработкой эффективных методов выделения и обратной транскрипции мРНК с сохранением всех типов кДНК, включая те, для которых соответствующие мРНК присутствуют в ничтожных концентрациях (например, мРНК дис-трофина при мышечной дистрофии Дюшенна (см. главу 10)). Единственным принципиальным ограничением методов детекции мутаций в последовательностях кДНК является невозможность выявления мутаций в регуляторных и интронных частях гена. Подобные мутации могут быть выявлены только при анализе геномной ДНК пациента.