Важным доказательством принадлежности клонированной ДНК к гену является идентификация гомологичных РНК-транскриптов в тканях, где можно предполагать экспрессию этого гена. С этой целью проводят гибридизацию уже отобранных по первым двум критериям клонов ДНК с тотальной мРНК, выделенной из этих тканей, а также скринир\-ют соответствующие библиотеки кДНК. Для генов наследственных заболеваний с неизвестным первичным биохимическим дефектом библиотеки конструируют из пораженных органов и тканей. При обнаружении последовательностей кДНК, гибридизующихся с геномными зондами, их, в свою очередь, используют для зондирования библиотеки и выявления всех клонов с перекрывающимися последовательностями кДНК. К сожалению, для генов с низким уровнем экспрессии гибридизация может не дать положительных результатов. Выделенные клоны, удовлетворяющие перечисленным критериям, с большой вероятностью содержат последовательности ДНК, являющиеся частями гена. Однако всегда существует опасность выбора какого-то другого гена (или псевдогена), локализованного в той же области ДНК. Поэтому требуются дополнительные доказательства идентичности выбранной последовательности ДНК специфическому гену. Такие доказательства могут быть получены, например, при определении нуклеотидной последовательности кДНК и сопоставлении ее с аминокислотной последовательностью кодируемого этим геном белка. Веским доказательством в пользу правильности проведенной идентификации гена может быть обнаружение мутантных вариантов аллелей в изолированных последовательностях ДНК у больных, страдающих соответствующим наследственным заболеванием. Так, например, при идентификации гена муковисцидоза у 70% больных в клонируемой кДНК-последовательности была обнаружена однотипная мутация - делеция трех нуклеотидов - delF508. Наконец, решающим подтверждением правильности идентификации нужного гена является успешно осуществленная с его помощью генокоррекция первичного биохимического дефекта, выполненная на соответствующих культурах мутантных клеток, или получение стойкого терапевтического эффекта у трансгенных животных - биологических моделей данного наследственного заболевания.
