До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клонирование являлись единственными способами поиска и выделения специфических геномных или кДНК последовательностей с целью их дальнейшего исследования. Не говоря уже о большой трудоемкости этих методов, они имеют ряд принципиальных недостатков и ограничений. Во-первых, исследуемые фрагменты значительно превосходят по длине ДНК-зонды и слишком велики для прямого молекулярного анализа. Концы этих последовательностей не могут быть выбраны произвольно, так как определяются наличием соответствующих рестрикционных сайтов в исследуемой молекуле ДНК. Во-вторых, для проведения успешной рестрикции и гибридизации необходимо большое количество хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК (не менее 10 мкг на одну реакцию). Такое количество ДНК обычно получают из 3-5 мл крови. Часто это количество оказывается слишком большим, если учесть, что речь идет о детях и о тяжелобольных людях. Кроме того, необходимость немедленного использования собранной крови для выделения ДНК или хранения ее до использования при -20 °С затрудняет исследование нетранспортабельных пациентов или родственников, проживающих на большом расстоянии от исследовательских центров. В-третьих, для геномной гибридизации, как правило, необходимы радиоактивные ДНК-зонды с высокой удельной активностью не менее 108-109 имп/(мин-мкг), причем они должны быть использованы в течение очень короткого периода после их приготовления. Кроме того, работа с радиоактивным материалом требует соблюдения необходимой техники безопасности и наличия специально оборудованного изотопного блока, что возможно лишь для некоторых диагностических центров. В-четвертых, необходимость длительной экспозиции автографов значительно удлиняет время получения результатов, что также ограничивает использование методов блот-гибриди-зации для пренатальной диагностики плода, специфика которой во многом определяется сроком беременности.
Предложенный в 1983 г. американским исследователем Карри Мул-лисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993 г., альтернативный метод анализа геномной ДНК - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) - явился эпохальным открытием молекулярной биологии нашего века. Метод ПЦР, или специфической амплификации ДНК, позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, реже до 1000 - 2000 п.о., используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезированными праймерами - олигонуклеотидными последовательностями ДНК длиной обычно от 15 до 30 п.о., комплементарными З'-концам амгашфицируе-мого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул. В качестве матрицы для синтеза может быть использован любой тип ДНК - геномная ДНК отдельных индивидуумов различных видов про- и эукариот; ДНК, выделенная из культур клеток, бактериальных клоиов, библиотек геиов или из других источников. Для проведения специфической амплификации не требуется больших количеств матричной ДНК и, в принципе, достаточно даже одной молекулы [Li С. etal., 1988].
Успех в разработке метода ПЦР в значительной мере связан с использованием в качестве фермента, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур [Kogan S.C. et al., 1987].
