Cхема полимеразной цепной реакции

     На первом этапе исследуемая двухнитевая матричная ДНК перево­дится в однонитевую форму путем ее нагревания в течение нескольких минут до температуры, превышающей 95-98 °С. Дальнейшая схема про­ведения ПЦР достаточно проста и заключается в чередовании циклов:
- гибридизации, или отжига, ДНК с праймерами;
- синтеза последовательности, комплементарной матричной ДНК;
- денатурации образовавшихся двухнитевых структур.
При гибридизации, достигаемой за счет понижения температуры реак­ционной смеси до 30-50° С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго специфичных областях, комплементарных праймерам. При температуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы, 60-70 °С, начинается синтез ДНК в направлении 5' - 3' с двухнитевого участка, об­разованного праймерами. Затем при нагревании раствора примерно до 80-90 °С синтез прекращается, и двухнитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК расплавляется (денатурирует). В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а затем (в последующих циклах) и с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифицированного участка, что и определяет, в конечном счете, размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.
Таким образом, при каждом цикле происходит двухкратное увеличе­ние числа синтезированных копий выбранного для амплификации участка ДНК, и содержание продуктов амплификации в растворе нарастает в гео­метрической профессии. Каждая из процедур цикла определяется двумя параметрами - температурой реакции и ее длительностью, меняющейся в диапазоне от десятков секунд до 1 - 3 мин, так что полный цикл длится от одной до нескольких минут. За 25 - 30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов. ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы -термоциклеры или амплификаторы ДНК. Такой прибор позволяет зада­вать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла из большой и часто непрерывной шкалы возможных вариантов. В техническом испол­нении ПЦР очень проста. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопраймеры, смесь dNTP и термофильную ДНК-полимеразу - добав­ляют в специфический буфер (часто одномоментно), наслаивают неболь­шой объем вазелинового масла для предотвращения высыхания раствора, затем помещают пробирку с реакционной смесью в автоматический тер-моциклер и выбирают необходимую программу циклической смены температуры и длительности каждого шага реакции. Общий объем реакцион­ной смеси обычно составляет от 10 до 50 - 100 мкл. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифицируе-мого участка. Следует подчеркнуть, что реально для каждой полимераз-ной реакции в зависимости от типа праймеров, длины амплифицированно-го фрагмента, особенностей его первичной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой термофильной ДНК-полимеразы оптимальные режимы температуры и состав амшшфикационной смеси могут существенно варьировать и зачастую подбираются эмпирически.