Следующими этапами анализа отобранного и клонированного ДНК-фрагмента являются его физическое картирование и определение нук-леотидной последовательности, т. е. секвенирование. Методология сек-венирования достаточно проста и заключается в том, чтобы получить серию комплементарных молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике, однако, определение нуклеотидной последовательности протяженных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую задачу. Существует два основных метода секвенирования: химическое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование -метод Сэнджера. В первом случае используют химическое расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез на заданном основании.
Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так как он более надежен и прост в исполнении. Принцип данного метода показан на рис. 1.7. На первом этапе ДНК денатурируют, чтобы получить одно-нитевые молекулы. Затем добавляют секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олигонуклеотидную последовательность, комплементарную определенному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гибридизации праймера, т. е. для образования двухце-почечного участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную смесь ДНК-полимеразу и дезоксинуклеотидтрифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP, один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четырех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют один из специфических дидезоксинуклеотидтрифосфатов, или терминаторов -ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP (ddNTP). При встраивании ddNTP на место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается. Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различающихся по длине радиоактивно меченых фрагментов ДНК с одним и тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминатором на конце молекулы. После одновременного электрофоретического разделения этих фрагментов на четырех соседних дорожках и радиоавтографии размер синтезированных фрагментов может быть определен, а значит, определена и локализация дидезоксинуклеотидов, и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК. На каждом секвенирующем геле может быть определена первичная последовательность всего около 500 п.о. В своем первоначальном варианте этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим. Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК в Международной программе «Геном человека» еще несколько лет назад оценивалась в 1$. В качестве модификаций метода Сэнджера используют предварительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных на основе фага М13 для получения протяженных од-нонитевых участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвени-рованы без денатурации и праймирования. Очень эффективной оказалась система векторов тр8 и тр9, позволяющих вести сиквенс одновременно в обоих направлениях и прочитывать участки большей протяженности.
