Чаще библиотеки конструируют на основе фаговых или космидных клонирующих векторов, так как в таком виде легче хранить большие количества химерных ДНК. Для создания библиотек генов человека особенно удобны векторы, полученные на основе фага X, такие как EMBL3 или EMBL4. Пакующая способность этих векторов от 9 до 23 тыс. п.о., они содержат много удобных клонирующих сайтов, так что для инсерции ДНК могут быть использованы разные рестриктазы. Кроме того, эти векторы не содержат последовательностей плазмид, наиболее часто используемых для клонирования : pBR322 и ColEl. Это позволяет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не вырезая предварительно инсертированный в нее фрагмент. Для создания библиотек клонов, содержащих большие районы ДНК, используется технология искусственных дрожжевых хромосом - YAC. Последние представляют собой крупные (до 1 млн п.о.) фрагменты геномной ДНК человека, сшитые с центромерными районами хромосом дрожжей. После идентификации в таких библиотеках нужных клонов с инсертированными фрагментами чужеродных ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или космидных библиотеках.
Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на фильтрах с оли-гонуклеотидными, кДНК- или любыми иными ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека сконструирована на основе экспрес-сионного вектора (рис. 1.6). Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким образом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в результате инфицирования клеток одним рекомбинантным фзгом. Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики на другие чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот-гибридизацию с меченым ДНК-зондом или им-муноблот с мечеными антителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки фильтров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локализации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК последовательности, комплементарные зонду, или специфические антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных культурах производят именно в тех местах, где произошло потемнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения, отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринированию. Обычно инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать большие количества этой ДНК.
