Заметим, что присутствие плазмиды в бактериальной клетке вовсе не обязательно для обеспечения ее жизнедеятельности, так как при отсутствии антибиотиков в среде обитания бактерий штаммы, не содержащие плазмид, вполне жизнеспособны. Плазмиды имеют автономную систему контроля репликации, обеспечивающую поддержание их количества в клетке на определенном уровне - от одного до нескольких сотен плаз-мидных геномов на клетку. Обычно для клонирования выбирают плазмиды с ослабленным контролем репликации, что позволяет им накапливаться в клетке в большом числе копий. Конструирование плазмидных клонирующих векторов заключается во внесении изменений в систему контроля репликации и в добавлении или вырезании генов антибиотико-устойчивости или удобных для клонирования иных генетических элементов: специфических сайтов рестрикции, инициации и регуляции транскрипции и т.п. Чаще всего для клонирования используют плазмиды pBR322, ColEl или их производные.
Кольцевую молекулу плазмидной ДНК можно легко перевести в линейную форму путем единичного разрыва в месте локализации уникального сайта рестрикции. Присоединение (встраивание, инсерция) фрагмента чужеродной ДНК к концам линейной молекулы осуществляется с помощью специфических ферментов - лигаз, после чего гибридная плазмида вновь принимает кольцевую форму. Разработаны достаточно простые и эффективные методы трансформации бактерий, т. е. искусственного введения плазмид в бактериальные клетки. При этом присутствующие в плазмидах гены антибиотикоустойчивости используют в качестве маркеров трансформированных бактерий для их отбора на соответствующих селективных средах. При размножении трансформированных бактерий происходит увеличение числа копий инсертированного фрагмента ДНК. Таким образом, этот чужеродный для бактерий генетический материал может быть получен практически в любых количествах. Выделенная из бактерий плазмидная ДНК или изолированный из плазмиды инсертированный фрагмент могут быть в дальнейшем использованы в качестве ДНК-зондов.
