Рассмотрим более подробно методы выделения и идентификации фрагментов ДНК, необходимых для анализа или использования в качестве ДНК-зондов. Основным источником этих фрагментов являются искусственным образом сконструированные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск, или скрининг, нужных последовательностей ДНК разными методами в зависимости от специфических особенностей этих последовательностей. Библиотека генов - это полный набор клонированных перекрывающихся фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции или механического разрезания тотальной ДНК, выделенной из какого-либо специфического источника. В зависимости от происхождения ДНК различают геномные и библиотеки кДНК генов. Для конструирования геномных библиотек используют ДНК, выделенную из тканей, культур клеток, из отдельных хромосом или из фрагментов. При создании библиотек кДНК выделяют тотальную мРНК из тканей или культивируемых клеток, в которых заведомо экс-прессируются интересующие исследователя гены. На следующем этапе методом обратной транскрипции (РНК-ДНК) синтезируют кДНК. Затем ее разрезают и упаковывают в выбранный для клонирования вектор.
Как видно, в геномных библиотеках присутствуют не только кодирующие последовательности генов, но также несмысловые внутриген-ные последовательности - интроны и межгенные участки ДНК, причем удельный вес некодирующих фрагментов ДНК значительно выше. Библиотеки кДНК состоят только из кодирующих - экзонных - областей генов. Наиболее удобный размер инсертируемой ДНК сопоставим со средним размером гена млекопитающих и составляет 15-25 тыс. п.о. Оптимальный по размеру набор перекрывающихся последовательностей геномной ДНК человека получается после ее переваривания частоще-пящими рестриктазами Sau3a или Mbol. Информационная емкость каждой библиотеки, т. е. количество клонов с различными инсертированными фрагментами ДНК, определяется размерами исходного генома и необходимостью присутствия каждой его последовательности хотя бы в одном клоне. Поэтому достаточно представительные геномные библиотеки млекопитающих обычно содержат не менее 8х105-106 различных клонов.
