вторник

Гибридизация с меченым ДНК-зондом

Гибридизация с меченым ДНК-зондом препаратов ДНК или РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предварительной рест­рикции и электрофореза, носит название дот- или слот-гибридизации в зависимости от конфигурации пятна ДНК на фильтре - округлой или продолговатой, соответственно.  Попутно отметим, что метод гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит название Нозерн-блот, тогда как Вестерн-блот, или иммуноблот, -это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксирован­ных на фильтрах, с мечеными антителами. Название этих методов -дань уважения молекулярных генетиков проф. Э. Саузерну, внесшему неоценимый вклад в разработку экспериментальных подходов, исполь­зуемых для анализа ДНК. В ряде случаев для проведения гибридизации с ДНК-зондами не требуется предварительного выделения и очистки ДНК. Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромосомных препаратах. Этот метод носит название гибридизации in situ. Вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, меченые флюорохромами, называется FISH (fluorescein in situ hybridization). Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференци­ально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатуриро­ванных) метафазных хромосом. Предварительная обработка хромосом направлена на облегчение доступа зонда к геномной ДНК. Важное зна­чение имеет также подбор условий, максимально способствующих про­цедуре гибридизации. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании радиоак­тивной метки), либо проведения соответствующей обработки (при ис­пользовании биотин- или флюоресцеин-меченых ДНК-зондов) места локализации последовательностей ДНК, комплементарных использо­ванному ДНК-зонду, можно непосредственно наблюдать в микроскоп в виде характерных точек над соответствующими участками определен­ных хромосом