Для клонирования субхромосомных фрагментов ДНК, содержащих целые гены, разработана система дрожжевых минихромосом. Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC - yeast artificial chromosomes) конструируют на основе плазмидных векторов, содержащих в своем составе известные центромерные и теломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые для поддержания и репликации векторов в клетках хозяина. Такие системы способны удерживать фрагменты чужеродной ДНК размером в несколько сотен тысяч и даже миллионов пар оснований.
Остановимся коротко на методах введения векторов в клетки хозяина. Но прежде всего определим основные термины. Как уже упоминалось, введение плазмидной ДНК в бактериальные клетки называется трансформацией. Если перенос генов осуществляется с помощью фага, то говорят о трансдукции. Процесс введения экзогенной ДНК в эукариотические клетки называется трансфекцией. Все эти методы основаны на подборе условий, облегчающих прохождение плазмидной или фаговой ДНК через клеточные и ядерные мембраны. Для повышения проницаемости мембран используют два разных подхода. В первом случае проводят обработку векторной ДНК и клеток хозяина буферными растворами, повышающими проницаемость клеточных и ядерных мембран (метод кальций-фосфатной преципитации, DEAE-декстран-опосредованная трансфекция). Во втором случае используют краткосрочное физическое воздействие на клетки для создания в мембранах микропор, проходимых для макромолекул ДНК (метод элек-тропорации - воздействие высоковольтным электрическим полем, «бомбардировка» частицами золота и т. п.). Более подробно проблемы векторов и методы генетической трансформации (трансдукции) рассмотрены в главе 9. Вопросам молекулярного клонирования также посвящена обширная литература [Маниатис Т. и др., 1984; Гловер Д., 1988, 1989; Дейвис К., 1990; Шишкин С.С., Калинин В.Н., 1992; Sambrook J. et al., 1989].
